益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的调控作用第四部分

王益萍

第四部分

细胞角蛋白18、天冬氨酸氨基转移酶、血小板、甘油三醋

          联合预测非酒精性脂肪性肝炎的发生

前言

    随着生活水平的提高，高脂高热量饮食摄入增多，NAFLD已成为主要的社会公共卫生问题，是目前仅次于病毒性肝炎的第二大肝病病因。在欧美发达国家，其已成为慢性肝病及肝功能异常最常见的原因，在我国成人发病率为15%，并逐年增长呈低龄化趋势[m。临床上NAFLD往往与其他疾病并存，并非独立存在。当药物、肝毒性物质、感染、病毒等损肝因素导致肝衰竭时，一方面，这些因素可直接或间接作用于肝细胞，导致细胞凋亡、坏死;另方面，NAFLD时肝细胞肿胀，胞浆内可见大量脂肪沉积，脂变的肝细胞解毒代谢功能减弱，无法抵抗损肝因素的破坏作用，从而进一步加重肝脏损伤。NAFLD对肝脏损害的协同作用在肝衰竭的疾病进展中不可忽视，早期诊断NAFLD同时结合及时有效的治疗，在一定程度上有助于延缓疾病进展，提高患者生存质量，预防肝衰竭的发生。

    NASH是NAFLD的一种亚型，与遗传、环境、代谢、应激等因素相关。除此之外，NAFLD的疾病谱还包括非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver, NAFL、脂肪性肝硬化及肝细胞癌。众所周知，被认为是良陛病变的NAFL，大多数可多年不进展，但还有约25%可发展为NASH。当肝脏炎症长期持续存在五到十年时，又有约15%-25%的的NASH患者进展为肝硬化降，甚至出现肝衰竭、肝癌等并发症}4-5} o NAFL与NASH的早期临床表现极其相似，对于NASH与NAFL的鉴别及NASH的早期诊断在临床工作中极为困难。其中，NASH是NAFLD疾病进展的重要限速步骤，及时有效地治疗NASH可以延缓疾病进展为脂肪性肝硬化甚至是肝细胞癌的速度。因此NASH的早期诊断已成为肝衰竭防治重点之一。

    目前，肝组织病理学检查仍是诊断NASH的金标准，并可提供及时准确的预后信息。然而由于大多数NASH患者无或仅有轻微临床症状，难以接受费用昂贵且有创性的病理检查，使得在临床上无法获得有效的诊断依据。无创诊断技术将成为诊断NASH的主要手段，这些技术多从发病机制入手，以简单快速准确有效的诊断为目的。其中，无创诊断模型更是当前的研究热点。已有多名学者运用数学模型对NASH进行诊断，但研究结论尚存在争议，且缺乏适用于中国人群的无创诊断方法。

    本研究旨在通过对非酒精性脂肪性肝病患者血液标本进行相关指标的检测，应用统计学方法进行分析处理，得到适用于我国的无创诊断模型，从而为NASH的诊断，也为肝衰竭的预防提供新思路。

材料与方法

1研究对象

    2009年4月至2011年11月在河北医科大学第三医院门诊或住院的患者，男性22例女性73例，年龄24-77岁。入选患者均需行肝活检，诊断符合中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组制定的非酒精J陛脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)[6]，同时排除酒精性脂肪性肝病((5年内乙醇摄入量男性>40克/天或女性>20克/天)或过量饮酒(男J陛乙醇摄入量习40克/周或女性>70克/周);病毒性肝炎;自身免疫性肝病;药物或毒物诱导的肝损害;遗传代谢性疾病(Wilson's病、血色素沉着症、al抗胰蛋白酶缺乏症等);胆道梗阻。

    本研究经医院伦理委员会批准并取得所有患者及其家属同意，签署书面知情同意书。

2观测指标与方法

    实验室指标的检测:清晨空腹无菌采集人外周静脉血，留取血清、血浆，送与我院检验科用于与NAFLD发病机制相关指标的检测，主要包括ALT, AST、总胆红素(total bilirubin, TB )、白蛋白(albumin, ALB ) ,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP )、Y一谷氨酞转肤酶(y-glutamyl

transpeptidase, y-GT )、国际标准化比率(international normalized ratio,INR )(反应肝脏储存功能);血小板、白细胞(white blood cell, WBC )、肌配、尿酸(uric acid, UA )、空腹血糖(fasting glucose, FG )(与糖代谢有关);甘油三酷(triglycerides, TG )，胆固醇(total cholesterol, TC ) (与脂质代谢有关);血红蛋白(与氧化应激有关);超敏反应蛋白(hs-Creactive protein, hs-CRP )(与炎症有关);铁蛋白(危险因素)。ELISA法测定血清细胞角蛋白18 (cytokeratin 18, CK 18 )凋亡片段M30  (与肝细胞凋亡密切相关)的水平，试剂盒购自德国PEVIVA公司，具体步骤依照说明书进行。

    高危因素指标的检测:所有入选对象均于清晨空腹赤脚，着轻便服装测量身高、体重、腰围、臀围，误差为0.1厘米和0.1千克。通过问诊获取患者年龄、性别及吸烟习惯(0=不吸烟者;卜曾经吸烟者;2=吸烟者)。体重指数(bo即mass index, BMI )一体重((kg)/身高2 (cm2 );腰臀比(waist-on-hip ratio, WHR)一腰围(cm ) /臀围(cm );糖尿病(有降糖药物应用史和/或空腹血糖>126mg/dL );高血压(有降压药物应用史或一天至少两次血压>140/90mmHg );血脂异常(有降脂药物应用史和/或空腹TC > 200mg/dL和/或空腹TG> 150mg/dL )。

3肝组织病理学检查

    10%福尔马林固定标本，梯度酒精脱水，二甲苯透明浸蜡后，将肝组织切成小块包埋制成石蜡块，连续5 hum厚切片。常规HE染色观察肝组织普通病理变化，Masson染色观织纤维化的程度，蓝染部分为胶原纤维，用多功能病理图象分析仪分析图像。应用NAFLD组织学评分系统对肝组织病理结果进行评定[m。该评分系统主要包括:脂变  (0=}5%}  1=5%-33%} 2=34%-66%} 3=>66%)，小叶内炎症(0一无炎症灶，1=每200倍光镜下<2个炎症灶2=每200倍光镜下2-4个炎症灶，3一每200倍光镜下>4个炎症灶)，气球样变(0一无，1=罕见或少量，2=许多)，纤维化(0=无，1=轻或中度窦周或汇管区纤维化，2=窦周及汇管区纤维化，3=桥接纤维化，4=肝硬化)。根据肝组织病理学检查结果，将所有纳入的研究对象分为两组，即非一非酒精性脂肪性肝炎组(non-nonalcoholic steatohepatitis, non-NASH)和NASH组[sl。

4统计学处理

    正态性数据以x士s表示，t检验进行组间比较;非正态数据以中位数和四分位数表示，组间比较用MannWhitney U检验;分类数据以频数和百分比表示，卡方检验或Fischer's精确检验进行组间比较。Kappa统计量用于病理结果一致性检验。相关性分析采用Spearman相关法。采用Logistic回归模型进行多因素逐步回归分析，计算各因素的比值比(oddsratios, OR)及其95%可信区间(95% confidence intervals, 95% CI )。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic, ROC)及曲线下面积  (  area under ROC, AUROC)分析NASH的诊断效能。双侧P}0.05为差异有统计学意义，应用SPSS 13.0统计软件分析实验数据。

结果

1人口学及实验室指标的变化

    Non-NASH组和NASH组患者年龄、性别构成比、吸烟习惯、糖尿病、高血压、血脂异常、收缩压(systolic blood pressure, SBP)和舒张压  (  diastolic blood pressure, DBP )、TB, WBC、血红蛋白、肌配、M,FG, TC和铁蛋白水平差异均无统计学意义(均P>0.05 )，而NASH患者BMI, WHR、血清AST, ALT, ALP, y-GT, UA, hs-CRP, TG和血小板水平均较non-NASH组明显升高，血清ALB水平则明显降低(均P}0.05)(见Table 1)。

2肝组织病理学变化

    所有入选对象均接受肝组织病理学检查，其中non-NASH组患者51例，NASH组患者44例。样本长度、汇管区数量，及肝组织脂变、炎症、气球样变和纤维化评分见Table 2。病理结果一致性良好，Kappa值为0.874。

3血清CK 18片段M30水平及其与肝组织病理学特征的相关性分析

    NASH组患者血清CK 18片段M30水平(372.9U/L ( 319.6, 431.4 ))较non-NASH组(248.1U/L ( 237.5, 266.6 ))明显升高(P}0.001)(见Fig.l )。其与肝组织脂变((r=0.492 )、气球样变((r=0.211)、汇管区炎症(r=0.346 )和纤维化分级(r=0.407 )均成正相关(均P}0.05 )。

4多变量分析

    BMI, WHR、血清AST, ALT, ALP, ALB, y- GT, UA, hs-CRP,TG, CK-18片段M30及血小板均纳入多变量模型分析。ALT(OR=1.078,95% CI: 1.020-1.139, P=0.007 )，血小板(OR=1.013, 95% CI: 1.001-1.025,P=0.040 )，CK-18片段M30 (OR=1.012, 95% CI: 1.003-1.021, P=0.011)和TG C OR=1.006, 95% CI: 1.001-1.012, P=0.019)是NASH的预测因素(见Table 3 )。四个指标的AUROC分别为0.811  } 95% CI:0.722-0.899)、0.631(95% CI: 0.515-0.746)、0.892(95% CI: 0.824-0.960)和0.714 ( 95% CI: 0.611-0.818 )(见Table 3 )。其中血清CK-18片段M30水平与ALT(r=0.639 )和TG(r=0.390)水平均成正相关(均P}0.05 ) ,与血小板无相关性(P>0.05 )。

5 NASH预测模型

    Logistic回归分析得到NASH预测模型，具体公式为-12.764+0.075 XALT ( U/L ) +0.013、血小板(X 109/L ) +0 . 012 X CK-18片段M30 ( U/L ) +0.006 X TG ( mg/dL )。该模型的AUROC为0.920 ( 95%CI: 0.866-0.974 )，临界值为0.361，敏感性、阳性预测值和阴性预测值均为89%，特异性为86% o

讨论

    长期以来，多个纵向研究表明，良性NAFL可进展为NASH}9}。与NAFL相比，NASH死亡率高，常合并肝脏相关并发症。因此，及时准确诊断NASH和规范化随访可以预测NAFLD的疾病进展，对预防肝衰竭有一定作用。NASH诊断的金标准即肝组织病理学检查由于自身缺点，难以在临床诊断中发挥其应有的作用，于是探索其他行之有效的无创性诊断方法，尤其是无创诊断模型，已成为当前研究的热点。

    从发病机制入手是诊断NASH的关键所在。NASH作为NAFLD的一种亚型，发病机制尚不十分清楚。目前公认的是Day等提出的“二次打击，，学说，即初次打击主要是胰岛素抵抗导致肝脏发生脂变，第二次打击是由多因素参与的病理生理环节，主要包括脂质过氧化、增多的反应J陛氧化代谢产物和游离脂肪酸等。

    胰岛素抵抗既是NAFLD的初次打击，也是代谢综合征的核心环节，胰岛素抵抗是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素本身的生物学作用敏感性下降，即正常剂量胰岛素所产生的生物学效应低于正常值，表现为肝脏葡萄糖产生能力降低，骨骼肌利用葡萄糖能力受损以及脂肪细胞分解能力下降等，导致脂肪在肝细胞中蓄积，引起肝细胞肿胀，发生脂变。胰岛素抵抗被认为是NAFLD的始发因素，贯穿疾病始末，约有80%NASH患者存在胰岛素抵抗现象「Ion0胰岛素抵抗与代谢综合征联系密切，因此NAFLD常并发代谢综合征，与肥胖、高血压、脂代谢紊乱、糖代谢异常等同时存在。

    氧化应激、增多的游离脂肪酸和血清细胞因子等均可参与二次打击加速NAFLD的进展。其中，氧化应激是二次打击的重要因素，与肌细胞、胰岛p细胞、肝细胞线粒体功能不全肝细胞色素P450 2E1的表达增加等有关[U‘一‘a}0氧化应激时，肝细胞内增多的游离脂肪酸在线粒体内大量氧化，导致活性氧产生增多，同时还可增加细胞膜通透性，从而使细胞线粒体DNA受到损害，损伤的线粒体亦可进一步增加活性氧和脂质过氧化物的产生，故而形成恶性循环，加重肝脏损伤。

    多项研究发现与发病机制有关的实验室指标在NAFLD患者中明显异常。Kashyap等[13]观察到NAFLD患者血清TG, AST和ALT水平在疾病进展过程中逐渐升高;Feldstein等[14]也报道NASH患者血清AST水平明显高于非NASH患者;Raza等发现NASH和NAFL患者糖尿病发生率存在差异;Liu等还发现与氧化应激相关的血红蛋白水平在NASH患者中明显高;Sirota等证实UA水平与NAFLD病情严重程度相关;患者年龄、BMI、血清TC, FG,胰岛素、糖化血红蛋白水平在NASH中明显升高[ys-19}。由于上述研究大多在欧洲国家进行，研究对象的入选标准不尽相同，诸多因素如饮食习惯、种族等差异均导致这些研究结论无法完全适用中国人群。在我国，由于大多数NASH患者无或仅有轻微的临床症状，仅在体检中发现，因此本研究选取在常规体检中且与NAFLD发病机制密切相关的实验室检查指标进行检测，发现NASH患者肝脏损伤程度、BMI, WHR、血清UA, hs-CRP, TG和血浆血小板水平明显高于non-NASH组。其中血小板水平与已有报道的研究结果不一致，如NASH或进展期肝纤维化患者中血小板水平低下[20-22] } NASH和非NASH患者血小板水平无显著差异[}2n等，这可能与研究纳入的样本量大小、研究中心数量有关。

    除已公认的“二次打击，，学说之外，细胞凋亡在NAFLD中也发挥着重要作用。临床和动物研究都发现NASH的突出病理学表现是肝细胞凋亡，是NASH发生和进展的中心环节。CK-18与肝细胞凋亡密切相关。细胞角蛋白是一种细胞骨架蛋白，存在于所有哺乳动物中。CK-18属于I型细胞角蛋白，主要表达于腺上皮，是一种由坏死上皮来源细胞凋亡产生的细胞内蛋白。肝脏是体内最大的腺体，CK-18在正常肝组织中即有少量表达，发挥保护肝细受各种机械性或非机械性损伤的作用。肝细胞发生凋亡时，CK-18在蛋白水解酶caspase的作用下，被从两个位点(Asp238和Asp396)裂解成三个片段释放入血，其中在Asp396作用位点分裂的一个片段被单克隆抗体M30特异性识别，在血液中的浓度极其稳定，对凋亡具有高度的特异性[[24]。在众多肝脏疾病中，如病毒性肝炎、NAFLD、酒精性肝病、肝硬化、肝细胞癌等，均发现CK-18水平的升高[}2s} o CK-18片段M30水平是反映细胞凋亡的主要血清学指标}26}。在肥胖或胰岛素抵抗患者的临床队列研究中发现血清CK-18片段与肝组织炎症、纤维化有关，CK-18已成为预测NASH肝脏组织学特征的潜在生物标记物[14,  27-30]。本研究应用ELISA方法检测入选对象血清CK-18片段M3 0水平发现NASH组患者明显升高，且与肝组织病理学特征(脂变、炎症、纤维化程度)成正比，提示CK-18与NAFLD的严

重程度密切相关。

    NAFLD的发病机制极其复杂，单凭某一指标诊断NASH是不可取的，只有结合多个相关指标才能较为全面准确的诊断NASH o Palekar等[31]将危险因素整合用于鉴别NAFL与NASH;  Campos等}ao}建立临床评分系统用于NASH诊断，纳入的指标有高血压、糖尿病、AST>27 U/L,

ALT>27 U/L、阻塞性呼吸睡眠暂停和非黑种人;Gholam等发现结合肝损伤指标(AST, ALT)和高血糖指标(糖基化血红蛋白、合并糖尿病)可以快速预测NASH和肝脏纤维化oynard等[33]提出并验证了NASH检验可作为诊断NASH的新方法;Francque等[34]则提出包含ALT,空腹C肤和肝脏脂变超声评分在内的新的计算公式可以预测NASH的发生;最新研究还发现，体循环中两个凋亡标记物—CK-18、可溶性Fas可预测NASH }}5} ;   Wong等[36]应用CK-18和纤维细胞生长因子21用于诊断NASH。这些研究几乎均来自非亚洲国家，纳入的研究对象多数为过度肥胖患者，选取的指标只局限于NAFLD发病机制中的某个方面，甚至有的指标仅用于医学研究，很少应用于临床检查，故上述方法的诊断效能值得商榷。

    为了弥补上述缺陷，寻求适用于中国人群的NASH诊断方法，本研究纳入与肝脏储备功能、糖代谢异常、脂质代谢异常、氧化应激、炎症、细胞凋亡、等发病机制相关指标和危险因素指标，且多为体检中常见检查项目。其中CK-18片段M30虽然目前未列入NAFLD的常规检查指标，但已成为公认的反映肝细胞凋亡的主要血清学指标，在NASH诊断中的作用不可忽视。通过分析，我们发现CK-18连同ALT、血小板、甘油三酷组成的无创诊断模型可以快速准确地诊断NASH。该模型的建立可能在延缓NAFLD病情进展，改善预后及预防肝衰竭中发挥一定作用。

    当然，本研究尚存在几点不足:第一，样本量较少;第二，仅包括一个研究中心;第三，乏验证研究和对NASH预测模型的动态研究。综上所述，NASH无创诊断模型尚处于探索阶段大型多中心研究、临床验证和预测模型的动态研究是今后的主要研究方向。

                              小结

    1血清CK-18水平与肝脏脂变、炎症、纤维化程度成正比，提示其可间接反映肝组织损伤程度，对于NASH的诊断至关重要。

2由CK-18, ALT、血小板和甘油三酷组成的无创诊断模型可准确预测NASH的发生，该模型可能在延缓NAFLD病情进展，改善患者预后及预防肝衰竭中发挥一定作用。

结论

    1应用D-氨基半乳糖腹腔注射小鼠可以成功复制ALF模型，其中血浆LPS水平的升高在ALF的发生发展中起着重要作用。

   2 ALF小鼠血浆中升高的LPS可使肝组织内巨噬细胞活化，激活细胞内Notch信号通路，促进晚期重要炎症介质HMGB 1和抗炎细胞因子IL-10的分泌，其中以升高HMGB 1为主，参与肝脏的炎症损伤过程，加速ALF的疾病进展。

    3益生菌可通过降低ALF小鼠血浆LPS水平，减少肝组织中巨噬细胞的活化，抑制Notch信号转导，降低HMGB 1和IL-10的水平，从而发挥保护肝脏的作用，为临床预防ALF提供了新的思路和方向。

4由CK-18, ALT、血小板和甘油三酷组成的无创诊断模型可准确预测NASH的发生，该模型可能在延缓NAFLD病情进展，改善患者预后及预防肝衰竭中发挥一定作用。

综述

肝功能衰竭动物模型的研究进展

    肝衰竭是一种严重肝脏损害，预后极差，病死率极高。可由多种因素(病毒、药物、肝毒性物质、代谢疾病等)引起，导致肝脏合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血功能障碍、黄疽、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群[fll。根据病理组织学特征和病情进展速度，肝衰竭可分为四类:急性肝衰竭、亚急性肝衰竭、慢加急性(亚急性)肝衰竭和慢性肝衰竭[fll0

    肝衰竭发病机制极其复杂，至今尚未完全阐明，已成为最具挑战性的临床医学重点难点问题，首选治疗方案是肝移植。由于供肝缺乏，手术费用昂贵，技术操作困难，肝移植术后需长期使用免疫抑制剂等，这些因素均导致外科治疗在临床上的应用受到限制f2-}l。近年来，虽然内科治疗中的人工肝支持技术、分子吸附循环系统和细胞移植等方法对受损肝细胞达

到一定的保护作用，但未达到理想的治疗效果，仍以改善病情，延缓疾病

进展，延长生存时间，提高患者接受外科手术的几率为首要任务[4-9]0

    近年来对于肝衰竭的研究日益成为人们的关注热点，动物模型在其中发挥着至关重要的作用。理想的动物模型具有易操作、可重复、标本充足等特点。目前对于肝衰竭的动物模型主要涉及急性肝衰竭和慢加急性肝衰竭两个疾病类型，现就动物模型的制备综述如下。

1急性肝衰竭动物模型

    急性肝衰竭起病急、死亡率高、预后极差，发病2周内出现II度以上肝性脑病。急性肝衰竭动物模型的制备周期较短，目前常用的制备急性肝衰竭动物模型的方法有药物或肝毒性物质模型、感染模型、基因修饰模型和外科手术模型等。

1.1药物或肝毒性模型

    目前主要常用于制备化学或药物模型的有D_氨基半乳糖、脂多糖、刀豆球蛋白A、醋氨酚、四氯化碳等。

1.1.1 D-氨基半乳糖联合脂多糖

    D_氨基半乳糖是广泛存在于糖蛋白、寡糖和糖胺聚糖中的一种氨基酸，又称半乳糖或软骨糖胺，是一种肝特异性毒性物质。D-氨基半乳糖最早于1968年由Keppler等以1. S g/kg的浓度注射大鼠造成肝细胞损伤模型，可见肝细胞坏死，呈气球样变性和嗜酸性变性等，肝组织的形态学改变与急性病毒性肝炎极其类似。研究认为，D-氨基半乳糖致肝损伤严

重程度与药物剂量相关，剂量越大，肝脏损伤越严重。

    D-氨基半乳糖对肝脏的损伤机制有以下几点:首先，研究普遍认为D-氨基半乳糖的直接细胞毒作用与肝细胞内尿普二磷酸有关，D-氨基半乳糖可与尿普三磷酸特异性结合，形成尿普二磷酸一氨基半乳糖复合物，导致尿普三磷酸含量下降，使二磷酸尿普葡糖明显减少，导致肝糖原及RNA合成障碍，影响肝脏能量代谢，最终造成肝脏严重损伤。另一方面，

Weisdorf等「“通过31P磁共振检查应用D-氨基半乳糖后肝脏磷的代谢过程，发现其中一个与非有机磷酸盐共振的代谢物，在用药后2h迅速增加，18h时恢复基线水平，高分辨率MRS检测证实代谢产物为1一磷酸氨基半乳糖。该产物由D-氨基半乳糖在机体内经过磷酸化后形成，可直接抑制二磷酸尿普葡糖焦磷酸酶，降低二磷酸尿普葡糖的含量，重复上述肝损伤过程。第三，D-氨基半乳糖还可与肝细胞膜特异性结合，破坏细胞膜的完整性。研究报道含有氨基半乳糖的共聚物注射给药后，发现药物和肝细胞膜有较高的亲和力。此外，D-氨基半乳糖还可耗竭肝内谷肤甘肤，促进肿瘤坏死因子的释放，加重肝脏损伤。已在氨基半乳糖所致大鼠肝损伤的模型中发现，肝脏内谷肤甘肤下降，给予N一乙酞半肤氨酸、尿pw A%}核普、低分子量的琉基化合物后可立即或Sh,12h后，使谷肤甘肤水平有所回升，对肝脏发挥保护作用[[ 12]0

    D-氨基半乳糖动物急性肝衰竭模型较好的模拟临床病毒性肝衰竭的发生、发展，以及模拟与临床相类似的病理、生理过程，具有肝外毒性不明显，效果可预测，用药剂量范围易控制等特点，但其价格昂贵。为了弥补这一缺陷，国内外学者通常联合脂多糖共同制备动物模型。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，脂多糖是内毒素的有效成分。脂多糖的单

独使用仅限于制备内毒素休克模型「，主要原理是脂多糖可引起微血管的功能发生改变，导致休克的发生。肠源性内毒素是肝衰竭的发病机制之一。脂多糖可活化肝脏内巨噬细胞，激活细胞内信号转导通路，促进炎性因子的释放，导致肝脏损害。

    D-氨基半乳糖与小剂量脂多糖联合制备急性肝衰竭动物模型，既可以减少D-氨基半糖的使用剂量，有效降低实验成本，还可以提高动物对脂多糖的敏感性，二者协同导致急性肝衰竭。这种方法制备的急性肝衰竭模型是目前药物性急性肝衰竭中与临床病毒性急性肝衰竭最为接近的比较理想的动物模型。

1.1.2刀豆球蛋白A

    刀豆球蛋白A是一种植物凝血素，累及器官仅限于肝脏[[14]。刀豆球蛋白A模型肝组织内可见大量淋巴细胞浸润，可激活以CD4十淋巴细胞为主的T淋巴细胞，刺激巨噬细胞促进肿瘤坏死因子a、千扰素Y等细胞因子的分泌，诱导与免疫调节、炎症发生有关的基因转录，介导肝脏特异性免疫损伤[}1 s-16}。其中肿瘤坏死因子a和千扰素Y是导致肝细胞直接损伤的炎症细胞因子，早期细胞因子是肝细胞损伤的主要因素[}1}-ls}。该模型与病毒性肝炎和自身免疫性肝炎所致肝损伤的发病机制相似，常用于此类疾病的研究。

1.1.3醋氨酚

    醋氨酚是一种肝毒性药物，又称对乙酞氨基酚或扑热息痛，是导致国外急性肝衰竭的常见原因之一，在八、九十年代已被广泛用于制造肝衰竭动物模型。正常剂量的醋氨酚可经葡萄糖代谢途径由肾脏排出，过量时则大部分转化为N一乙酞一苯醒亚胺，导致肝组织小叶中央型坏死。研究发现，醋氨酚除主要在肝脏代谢可造成肝衰竭以外，还具有心毒性、肾毒性和肺损伤等[ 19-20]0

1.1.4四氯化碳

    四氯化碳在体内被微粒体细胞色素P450氧化酶代谢后，生成毒性代谢产物，破坏生膜结构，导致细胞膜通透性增高，造成肝细胞死亡[[21 ]可通过动静脉注射、口服、灌胃等多种途径给药。四氯化碳模型较为经典，

可准确反应肝细胞功能和形态学变化，重复性好。但四氯化碳在动物个体间的差异较大，反应难以控制，且四氯化碳本身挥发性大，可经呼吸道或皮肤吸收，对实验也有一定的危险性。另外，其还可导致动物其他器官如肾、肺等的损害，肝性脑病在该模型中不常出现，故不适用于急性肝衰竭的肝性脑病研究。

1.1.5硫代乙酞胺

    急性肝衰竭中关于肝性脑病的研究多见于硫代乙酞胺制备的急性肝衰竭模型。进入机体的硫代乙酞胺可通过加单氧酶的生物转化作用直接导致肝细胞坏死，还可通过改变脑组织中鸟氨酸、精氨酸等氨基酸的含量，改变线粒体的渗透性和氧化应激等引起星形胶质细胞水肿，影响脑组织代谢和神经调节功能。除此之外，硫代乙酞胺导致线粒体谷肤甘肤、水通道蛋白4等的改变均与肝性脑病有关[}22}。硫代乙酞胺导致的肝损伤合并肝性脑病与临床肝性脑病表现极其相似，已被学者广泛接受[[23]0

    此外，鹅膏草碱、乙醇、氯化偶氮甲烷、抗Fas抗体等也可用于制备急性肝衰竭模型，但应用较少[24-26]0

1.2感染模型

    感染模型是应用肝炎病毒感染动物制备ALF模型的方法。ALF在我国的首要病因是病毒性肝炎，该类模型的成功制备可更直接更有效地模拟临床常见ALF的发病过程，便于进行多方面多层次的研究，然而此种方法的失败率极高。迄今为止，只有少数动物感染模型制备功}2}-2s}。如应用兔出血病病毒制备兔急性肝衰竭模型[f2}10

1.3基因模型

    基因修饰模型最早见于alb-uPA转基因小鼠模型，该小鼠体内过度表

达的异位uPA可引起肝细胞坏死，发生急性肝衰竭[}29}。另外，延胡索酞乙酞乙酸水解酶基因敲除小鼠和以白喉毒素受体为媒介的转基因鼠均导致肝损伤，出现ALF。该类模型主要用于研究代谢性疾病，探讨肝细胞生长移植的可能性及其增生的潜能。

1.4外科手术

    外科手术模型是发展较早的ALF模型，包括肝缺血模型、部分或全肝切除模型。

1.4.1肝缺血模型

    制备肝缺血模型的主要步骤是首先准备术前麻醉，分流门腔静脉，将下腔静脉和门静并行，施行侧侧吻合或端侧吻合，然后阻断肝动脉等肝脏血管，也可同时将胃十二指肠动脉及其侧支循环血管结扎「，吻合与阻断的间隔时间越长，模型动物出现急性肝衰竭和存活的时间就越长。肝缺血模型可根据肝动脉阻断的程度分为完全性阻断和暂时性阻断两种类型。但手术操作要求高，且均有手术反应。

1.4.2部分肝脏切除模型

    顾名思义，切除部分肝脏仅残存约20%-30%的肝组织，导致肝脏解毒、代谢、生物转化等功能严重失代偿，出现肝衰竭。已有研究成功制备猪部分肝脏切除模型和犬部分肝脏切除模型[33-35]。该模型不仅具有手术操作要求高和手术反应的缺点，还不能完全模拟急性肝衰竭肝组织病理改变和炎症细胞因子的释放特点。此外，由于肝脏切除量不同，导致肝损伤程度不同，残留肝脏易并发出血、感染等并发症。

1.4.3全肝切除模型

    全肝切除模型主要用于研究临床发生急性肝衰竭时，血清生化指标的改变以及出现的神经症状[[36-40]。但该模型缺乏急性肝衰竭时，体内毒素、炎症等细胞因子的变化特征，以及有关的病理生理改变。

    外科手术造成的肝脏缺血坏死和肝功能衰竭不可逆，故仅适用于生物人工肝代偿肝功能的研究，再加上生物人工肝系统支持的模型动物难以长时间存活，该类模型往往用于体外人工肝系统的短期评价[[30, 32]。外科手术模型具有操作较复杂，存在强烈的手术反应，可改变肝功能衰竭的病理生理状态等缺点。

2慢加急性肝衰竭动物模型

    我国临床上最常见的肝衰竭类型是慢加急性肝衰竭，是在慢性肝病的基础上，短期内出现急性肝功能的失代偿，主要病理表现为在慢性肝组织损伤的基础上(多为肝纤维化或肝硬化)，发生程度不等的新的肝细胞坏死性病变。慢加急性肝衰竭动物模型制备的关键在于模仿临床疾病发生过程，先造成长期肝脏损伤再给予肝脏急性攻击。目前对于慢加急性肝衰竭的动物模型的研究较少，方法还不成熟。主要有以下两种:

2.1人血白蛋白+D-氨基半乳糖联合脂多糖    段钟平团队[[41]应用人血白蛋白尾静脉注射6周后，给予D_氨基半乳糖联合脂多糖急性攻击制备大鼠慢加急性肝衰竭动物模型。结果发现人血白蛋白可免疫诱导大鼠肝脏损伤，主要表现为肝纤维化期，肝细胞轻度坏死，对动物损伤不明显;肝硬化期，假小叶内肝细胞少见变性和坏死，汇管区胆管增生程度轻，炎症细胞浸润不明显。人血白蛋白免疫诱导的大鼠肝纤维化或肝硬化形成的病理过程，与人体肝脏发生纤维化过程类似，且病理改变稳定，去除致病因素也不能自行恢复。D_氨基半乳糖和脂多糖联合急性攻击肝纤维化或肝硬化后4h可见再生结节内出现点灶状坏死伴白细胞反应，散在炎细胞浸润，局部出现嗜酸性圆形小体，汇管区轻度水肿;8h可见再生结节内坏死灶合或增多，汇管区及中央静脉周围水肿，炎细胞浸润程度增多;12h再生结节内肝细胞大面积坏死，呈脂变或空泡变J陛，炎症浸润程度较前更为严重。该动物模型成功模拟临床上慢加急性肝衰竭疾病进展过程。

2.2四氯化碳+D_氨基半乳糖

    朴正福等[42]应用50%四氯化碳植物油溶液腹腔注射连续3月，每3天1次，按照1. Sml/kg体质量注射一个月，之后2.Om1/kg体质量注射后两个月的方法首先建立大鼠肝硬化模型，随后以2g/kg体质量的D-氨基半乳糖给予大鼠腹腔注射共同制备大鼠慢加急性肝衰竭动物模型。相对于第一种方法而言，该模型制备时间较长，且D-氨基半乳糖给予大鼠腹腔注射后12h才出现肝衰竭相关的肝脏病理表现。

    慢加急性肝衰竭的动物模型制备比较困难，涉及到多个步骤多个环节。首先需选择合的药物或肝毒性物质导致动物肝脏发生肝纤维化或肝硬化，其次，在肝纤维化或肝硬化的基础上，再次给予肝脏急性损伤，经过这两次打击共同建立慢加急性肝衰竭动物模型，其中药物或肝毒性物质的千预方式、使用剂量、作用时间均会影响最终的造模结果。其中，第一阶段形成的肝脏病理损伤对慢加急性肝衰竭动物模型制备的成功与否至关重要。若此阶段的肝脏损伤程度轻微，即便经过第二阶段的再次急性攻击导致动物严重肝脏损害，甚至死亡，此时的肝脏病理改变与疾病的病理演变过程不相符，导致慢加急性肝衰竭的动物模型制备失败;反之，第一阶段导致的肝脏损伤过于严重，在未接受第二阶段的千预或千预起始，动

物便出现严重并发症甚至死亡，但导致动物死亡的主要原因不是由于第二次急性攻击造成亦不符合临床疾病的发展规律，也导致慢加急性肝衰竭的动物模型制备不成功。同样，即使第一阶段已造成肝纤维化或肝硬化，若第二阶段的急性攻击不成功，也导致最后造模失败。由此可见，在慢加急性肝衰竭动物模型的制备过程中，两个阶段需相互作用相互衔接共同发

挥肝脏损伤功能。

    理想的肝衰竭动物模型需具备可逆性，可重复性，有充足的治疗窗口期和标本，致死因为肝衰竭，对坏境和实验人员危害小，符合临床疾病进展过程及肝组织病理改变等。以上描述的动物模型仅是在一定程度上，或侧重疾病的某一方面研究急性肝衰竭或慢加急性肝衰竭的发病机理和相关药物的治疗机制，但每个研究均有各自的局限性，且尚缺乏大型动物模型。因此，建立规范化建模方法，探究所用千预肝毒性物质的使用剂量和千预时间，合理的操作方式，药物的千预剂量和对造模动物的作用时间，选择适用的动物种类，以及与临床肝衰竭极其类似的大型动物的病毒感染模型，尤其是非人灵长类动物模型，制备更接近临床病理改变和疾病演变过程的动物模型，是今后建立肝衰竭动物模型的研究方向。

参考文献

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