益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的调控作用第三部分

王益萍

第三部分

                   益生菌干预小鼠血浆调控巨噬细胞分泌

                      细胞因子的分子机制

前言

    在第一部分的体内研究中我们发现血浆LPS可激活肝组织内Notch信号转导通路，影响细胞因子晚期炎症介质HMGB 1和抗炎细胞因子IL-10的分泌，肝组织炎症坏死程度严重;应用益生菌千预后，Notch信号通路相关指标表达明显下降，血清细胞因子和肝组织病理结果均得到改善。由此可见，血浆LPS水平参与小鼠ALF的发生发展，且与Notch信号通路有关。研究还发现小鼠肝组织中巨噬细胞活化程度与LPS变化趋势相同，提示LPS对肝脏的致病作用很可能与巨噬细胞活化有关。为明确这一问题，我们进行了第二部分的体外研究，发现Notch信号转导通路可调控LPS激活的巨噬细胞分泌细胞因子HMGB 1, IL-10，该信号

通路是LPS致病的核心环节。

    在前期研究的基础上，为了进一步了解益生菌的作用与巨噬细胞功能的关系，我们模拟血清药理学方法，采用血浆药理学方法进行研究。目前血清药理学方法广泛应用于中药研究，由日本学者在80年代末率先提出[m。这一方法是将中药或复方配成一定浓度，以灌胃的方式给予动物服用一定时间后，采集动物血液标本进行分离，得到含有药物成分的血清，然后用此血清进行体外实验研究。该方法不仅可以直接反映药物对吸收部位的作用，还可以间接反映在机体作用下药物成分形成的代谢产物以及药物自身诱生的机体内源性物质，如激素、补体、千扰素等，所产生的生物学效应。由于益生菌主要通过补充有益肠道菌群，降低血浆中LPS的含量而发挥治疗作用，其疗效主要反应在血浆水平，故我们模拟血清药理学方法的制备过程，收集各组小鼠血液置于抗凝管中进行分离，提取血浆标本进行体外实验。

      本研究分别采用正常小鼠血浆、ALF小鼠血浆和益生菌千预小鼠血浆对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞进行千预，通过real time-PCR的方法检测RAW264.7细胞中Jagged 1, Notchl和Hess mRNA的表达情况，Western Blot的方法测定Jaggedl , Notchl , NICD和Hess的蛋白在

中HMGB 1, IL-10的表达变化，赏试剂盒检测细胞上清液中LPS水平，在揭示益生菌对巨噬细胞作用的分子机制。

材料与方法

1仪器设备:同第一、二部分。

2主要试剂:同第一、二部分。

3主要试剂的配制:同第一、二部分。

4方法

4.1含药血浆的制备

健康清洁级6-8周龄雄性BALB/c小鼠30只，体重(18-20) g，由河北医科大学动物实验中心提供。分笼饲养，每笼5只，按昼夜时程，在室温及稳定湿度条件下，用标准饲料适应性喂养1周，随机分为正常对照组(10只)、ALF模型组(10只)、益生菌千预组(10只)，操作步骤同第一部分。无菌取血置于EDTA抗凝管，4 0C 2000rpm 10-20分钟分离血浆，0.22}m滤膜抽滤除菌，-80℃冻存备用。

4.2细胞标本的制备

4.2.1细胞复苏与传代:同第二部分。

4.2.2细胞冻存:同第二部分。

4.2.3细胞计数:同第二部分。

4.2.4体外培养小鼠血浆千预的巨噬细胞株RAW264.7细胞

    小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种在六孔板中，每孔5X105个细胞，用含10%胎牛血清和90%高糖DMEM培养至70%融合时进行分组千预。

    正常小鼠血浆千预组:80%细胞完全培养基(10%胎牛血清+90%高糖DMEM) +20%正常小鼠血浆培养48小时。

   ALF小鼠血浆千预组:80%细胞完全培养基(10%胎牛血清+90%糖DMEM ) +20%ALF小鼠血浆培养48小时。

    益生菌千预小鼠血浆千预组:80%细胞完全培养基(10%胎牛血+90%高糖DMEM ) +20%益生菌千预小鼠血浆培养48小时。4.2.5细胞及上清液的留取:同第二部分。

5方法

5.1检测细胞上清液IL-10 , HMGB 1和LPS水平:检测方法同第一部分，严格按照试剂盒的说明书进行操作。

5.2 Real time-PCR法检测血浆千预RAW264.7细胞中Jaggedl , Notchl ,Hess mRNA的表达:同第二部分。

5.3 Western Blot法检测血浆千预RAW264.7细胞中Jaggedl , Notchl ,NICD, Hess蛋白的表达:同第二部分。

6统计学处理

应用SPSS 13.0软件处理数据，计量资料以均数士标准差表示，采用单因素方差分析，Student-Newman-Keuls法进行组间比较，双侧P}0.01为差异有显著统计学意义。相关性分析采用直线相关分析法。

结果

1小鼠血浆千预RAW264.7细胞上清液中I}VIGB 1, IL-10和LPS的含量变化

    正常小鼠血浆千预组细胞上清液中HMGB 1 ( 3 .433士0.674 }g/L )、IL-10 ( 286.524士33.507 pg/ml)和LPS ( 0.090士0.014 EU/ml)水平较低;ALF小鼠血浆千预组细胞上清液中HMGB 1 ( 34.691士9.058 }g/L ) , IL-10  (1812.736士185.574 pg/ml)和LPS (2.102士0.121 EU/ml)水平则较正常小鼠血浆千预组明显升高，差异有统计学意义(P值均<0.01);与ALF小鼠血浆千预组比较，益生菌千预小鼠血浆千预组细胞上清液HMGB 1(20.058士2.278  }g/L)、IL-10(1338.322士151.339  pg/ml)和LPS(1.220士0.069 EU/ml )水平均明显下降(尸值均<0.01)(见Fig.l,  Table

1)。

2刁、鼠血浆千预RAW264.7细胞内Jaggedl mRNA, Notchl mRNA, Hess

mRNA的表达

  RAW264.7细胞经ALF小鼠血浆千预后，细胞内Jaggedl mRNA (6.671士0.790)、Notch 1  mRNA(5.491士0.657)和Hess  mRNA  6.301士0.930 )水平均较正常小鼠血浆千预组明显升高(尸值均<0.01);加入益生菌千预小鼠血浆后，与ALF小鼠血浆千预组比较，Jaggedl

mRNA ( 4 .120士0.623)、Notch 1 mRNA ( 2.3 7 5士0.739)和Hess mRNA  (  3.657士0.755)水平显著降低，差异有统计学意义(尸值均<0.01)(见Fig.2，Table 2)。

3小鼠血浆千预RAW264.7细胞内Jaggedl , Notchl , NICD和Hess蛋

白的表达

    与正常小鼠血浆千预组(0.192士0.049, 0.168士0.070, 0.114士0.050,0.274士0.047 )相比，经ALF小鼠血浆千预的RAW264.7细胞内Jaggedl蛋白(0.631士0.067 ),Notchl蛋白(0.533士0 . 0 91) , NICD蛋白(0.600士0.086 )和Hess蛋白(0.803士0.087)水平均明显升高，差异有统计学意义(尸值均<0.01);当应用益生菌千预小鼠血浆进行千预后，细胞内Jaggedl蛋白(0.460士0.094 ),Notchl蛋白(0.326士0.069 ),NICD蛋白(0.332士0.064 )和Hess蛋白(0.605士0.097)水平均较ALF小鼠血浆千预组显著下降(尸值均<0.01)(见Fig.3 ,  Table 3 )。

4相关性分析

    小鼠血浆千预RAW264.7细胞上清液LPS水平与Jaggedl mRNA,Notchl mRNA, Hess mRNA, Jaggedl蛋白、Notch 1蛋白、NICD蛋白、Hess蛋白、细胞上清液HMGB 1和IL-10水平均呈正相关，相关系数分别为r=0.969, 0.911, 0.955, 0.931, 0.889, 0.937, 0.940, 0.913, 0.965  (P值均<0.01)。

讨论

    ALF的疾病进展是一个多步骤、多因素、多基因相互作用的过程，发病机制十分复杂。一般认为其主要经历三重打击:第一重打击是病毒、损肝药物、肝毒性物质等致病因素的直接作用，可导致肝细胞死亡，此时肝脏功能仅轻度受损，若去除致病因素，肝功能可恢复;第二重打击是致病因素的持续存在可诱发机体发生免疫反应，引起免疫损伤，造成肝细胞坏死以及大量炎性细胞浸润，此时肝脏功能较前明显受损;第三重打击是随着肝脏功能受损程度加重，解毒能力下降，此时肠道菌群失调，屏障功能遭到破坏，最终造成肠源性内毒素血症的发生。肝肠轴的存在与相互作用，形成恶性循环，进一步加速肝细胞死亡。在三重打击

的过程中，单核/巨噬细胞系统在其中发挥着重要的作用。    单核/巨噬细胞是固有免疫系统中的重要组成部分，肝脏内巨噬细胞主要定植于肝脏血窦内皮间，约占肝脏细胞总数的25%，占全身巨噬细胞总数的80%-90%，是体内最大的巨噬细胞群[2-4]。巨噬细胞是肝内LP的主要效应细胞，也是炎性细胞因子的主要来源。它既可以吞噬和清除肠道来源的微生物或毒素，又可以被细菌产生的LPS激活，启动细胞内一系列信号转导通路，释放炎性介质入血，激活大量炎性细胞，并在趋化因子的作用下，使得大量炎性细胞浸润在肝脏中，共同参与肝脏炎症反应[2-3, 5]。

    第一部分的研究发现巨噬细胞活化标记物CD6g在ALF小鼠肝组织内表达明显增加，应用益生菌千预后其表达水平下降明显，提示巨噬细胞的活化参与ALF的发生发展，益生菌可通过减少巨噬细胞活化而对肝脏发挥保护作用。益生菌主要是通过降低血浆LPS水平而发挥治疗作用，为此本研究应用各组小鼠血浆对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞进行千预，以探讨益生菌对巨噬细胞作用的分子机制。研究发现ALF小鼠血浆千预组细胞上清液HMGB 1, IL-10和LPS水平较正常小鼠血浆千预组明显升高，其中以HMGB 1升高为主，提示ALF时，血浆中升高的LPS可激活巨噬细胞同时分泌晚期炎症介质HMGB 1和抗炎细胞因子IL-10,由于HMGB 1升高幅度较IL-10明显，故抗炎因子不足以抵抗促炎因子的致炎作用，导致细胞发生炎症损伤。而益生菌千预小鼠血浆千预组细胞上清液中HMGB1, IL-10和LPS水平均较ALF小鼠血浆千预组显著下降，其中以HMGB 1下降最为明显，且细胞上清液中LPS水平与

HMGB 1, IL-10水平均呈正相关，提示益生菌千预小鼠血浆可通过降低LPS水平，减少巨噬细胞分泌HMGB 1和IL-10，尤其是降低HMGB 1的水平而发挥保护作用。Real-time PCR和Western Blot方法均显示ALF小鼠血浆千预组细胞内Notch信号通路相关指标mRNA和蛋白的表达均明显高于正常小鼠血浆千预组细胞，且与细胞上清液HMGB 1, IL-10和LPS水平呈正相关，提示ALF时，升高的LPS可活化巨噬细胞，激活胞内Notch信号通路促进HMGB 1, IL-10的分泌，从而参与ALF的疾病进展过程。益生菌千预小鼠血浆千预组显示Notch信号通路相关指标mRNA和蛋白的表达均明显低于ALF小鼠血浆千预组细胞，其同样与细胞上清液HMGB 1, IL-10和LPS水平呈正相关，表明益生菌主要通过降低LPS水平，进而减少巨噬细胞活化，减少Notch通路的信号转导，降低HMGB1, IL-10的水平，其中以降低晚期炎症介质HMGB 1为主，从而发挥对细胞的保护作用。

    本研究应用血浆药理学方法进行体外实验，更直观的研究益生菌对巨噬细胞分泌细胞因子的影响。此方法主要有以下几个特点:第一，含药血浆与动物模型的种属性相同。不同的动物种属含有不同的血浆成分，用异种动物的血浆培养细胞，可能因种属间的免疫排斥反应而影响实验结果。第二，含药血浆是动物模型的病理血浆而不是正常动物的血浆。益生菌进入机体后，主要通过补充肠道正常菌群，减少细菌LPS的产生。不仅如此，由于LPS水平的变化，使得全身多种神经体液物质也随之发生改变，这些免疫分子、细胞因子等可作用于机体的多个系统和多个部位而发挥生物学效应。因此，在正常血浆中添加药物成分是不可取的。

而且不同病理状态下制备的含药血浆，也会因机体状态的不同而不同，血浆内含有的内生性有效成分也会不同，从而影响实验结果。第三，含药血浆不灭活。鉴于第二点可知含药血浆中含有多种神经体液物质，如细胞因子、抗体、补体、蛋白酶及其它活性成分，可直观反映机体应用益生菌后的变化。这些变化与模型动物本身以及药物对机体的刺激作用均有关。故一旦灭活，这些物质的数量、状态、功能和活性都会发生改变，不能真实反映药物在机体中的作用。第四，根据药物作用原理制备含药血清或含药血浆。绝大多数中药或复方制剂作用的疗效主要表现在血清学水平，故制备含药血清进行体外实验是用于研究中药作用的最佳选择。而由于本实验中所用的益生菌作用效果主要体现在血浆水平，因此制备含药血浆进行体外实验可以更真实的反映益生菌在体内的治疗过程。

    综上所述，益生菌预防ALF的主要分子机制是通过降低LPS水平，减少巨噬细胞活化，进而抑制Notch通路的信号转导，降低HMGB 1,IL-10的水平，尤以降低晚期炎症介质HMGB 1为主，从而发挥对肝脏的保护作用。这就为临床上应用益生菌预防ALF提供了新的理论础和实验依据。在本研究中益生菌含药血浆降低HMGB 1和IL-10的程度不同，这是否与巨噬细胞内其他信号转导通路有关，目前尚不十分清楚，有待于进一步的深入研究。

小结

    1 ALF小鼠血浆可促进RAW264.7细胞分泌晚期炎症介质HMGB 1和抗炎因子IL-10，其中以HMGB 1为主，介导细胞损伤，此过程与Notch信号通路有关。

    2益生菌含药血浆作用于RAW264.7细胞可抑制Notch通路的信号转导，降低HMGB 1和IL-10的水平，发挥保护细胞的作用。这是益生菌预防ALF的主要分子机制。