益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的调控作用第二部分

王益萍

第二部分：

          Notch信号通路在脂多糖刺激巨噬细胞分泌

                    细胞因子中的调控作用

               

前言

    革兰氏阴性细菌过度生长是肠道菌群失调的主要表现，此时产生的大量内毒素是细菌的主要致病因素。内毒素的主要成分为LPS，是革兰氏阴性细菌细胞壁上的特有结构，通常在细菌快速生长或死亡裂解后产生释放。LPS的主要效应细胞是单核巨噬细胞，在第一部分的研究中已发现肝脏内巨噬细胞数量在ALF模型组明显升高，提示巨噬细胞在疾病进展中发挥着不可忽视的作用。研究认为ALF时，血液中升高的LPS既可直接对肝细胞生物膜造成毒性损伤，又可通过引发肝脏内单核巨噬细胞炎症级联反应对肝细胞造成间接损伤，后者导致的肝细胞损伤程度要远远超过前者[m0

    目前已经明确，LPS可激活巨噬细胞内两条经典信号转导通路  (  NF-KB信号转导通路和丝裂原激活的蛋白激酶信号转导通路)，释放大量炎症相关细胞因子，引起严重的炎症反应，使细胞形态、代谢功能异常，导致机体组织和器官的损伤，是全身炎症反应综合征、多器官功能障碍综合征，甚至多器官衰竭的重要发病机制之一[}2}。随着研究的深入，有学者发现除上述两条经典的信号转导通路外，LPS还可激活多种细胞内Notch信号通路发挥生物学作用。Notch信号通路可影响肿瘤的形成和发展，通过活化或抑制某些生长信号起到促进和抑制肿瘤生长的作用f}-4l;还可影响神经系统的发育，通过关闭神经原细胞bHLH基因的表达，阻止神经元的分化[}s};在Alagille综合征的研究中已发现Notch信号通路在肝脏稳态的持中也发挥着重要作用睁7];此外，近年来还发现树突细胞、乳腺癌细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、Thl细胞中Notch信号通路的激活与炎症相关细胞因子的释放密切相关[8-12]。但对于LPS激活巨噬细胞内Notch信号通路对细胞因子调控作用的研究较少，且存在争议。有的学者认为巨噬细胞内Notch信号通路的激活可促进炎性因子的释放[[13];然而另一些学者则认为Notch信号通路的激活可下调M1型巨噬细胞相关基因，降低炎症因子的表达[[14]0

    本实验通过体外培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，用LPS和Notch信号通路的特异性阻断剂DAFT进行千预，观察细胞上清液中炎J陛细胞因子代表HMGB 1和抗炎细胞因子代表IL-10的水平，以及Notch信号通路相关指标在RAW264.7细胞中的表达，旨在探讨Notch信号通路在LPS刺激巨噬细胞分泌细胞因子中的调控机制，为临床有效降低内毒素减轻肝脏损伤提供实验依据。

3主要试剂的配制

3.1 1 XPBS缓冲液:NaCl 8.5g, KC10.2g, Na2HP04}12H20 2.85g, KH2P040.27g, Hepes 2.38g, NaHC03 0.35g,酚红0.002g，超纯水定容至1 OOOmI o0.22}m滤器过滤除菌，4℃保存。

3.2胎牛血清的处理:用前检测血清无污染，56℃水浴30分钟灭活补体，分装后一80℃保存，用前24小时转至4℃冰箱保存。

3.3细胞完全培养基MEM高糖培养基++10%胎牛血清，0.22}m滤器过滤除菌，低温保存。

3.4细胞冻存液MEM高糖培养基+20%胎牛血清+8%DMSO，充分混匀，0.22}m滤器过滤除菌，低温保存。

3.5 LPS的配制PS冻千粉加入1 ml无菌1 XPBS缓冲液配成l Omg/ml储存液，4℃分装保存，即用即加。

3.6 DAFT的配制APT冻千粉加入1.2m1DMS0配成1 OmM储存液，-20℃分装避光保存(避免反复冻存)，即用即加。

4方法

4.1细胞冻存

    小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。将处于对数生长期的RAW264.7细胞冻存前12小时换液，使细胞处于良好的营养状态。在DMEM高糖培养基中加入20%胎牛血清和8%DMSO充分混匀配成冻存培养基，0.22}m滤器过滤除菌，低温保存备用。弃去细胞培养基，以1 XPBS缓冲液漂洗三遍后，0.25%胰蛋白酶消化细胞2-5分钟，加入适量DMEM高糖完全培养基并以弯枪轻轻吹打细胞离壁，收集细胞悬液，计数，1000rpm离心10分钟，弃上清。重复1次，弃上清。用冻存培养基重悬细胞至5 X 106/ml。轻轻吹打混匀细胞后按1 ml/管分装到无菌冻存管内。密封，贴上标签，置一80 0C冰箱过夜，取出后于1530分钟内放入液氮罐液面以下。

4.2细胞复苏与传代

    打开液氮罐，取出装有RAW264.7细胞冻存管，置盛有42℃温水的烧杯中，不断摇动使细胞快速融化，约1分钟完全融化后，将冻存管置于生物安全柜内操作。无菌条件下打开冻存管，将细胞悬液转入15m1离心管中，加入l Oml含10%FBS的DMEM高糖培养基，1000rpm离心5分钟，弃上清，悬浮细胞沉淀接种于含10%FBS的DMEM高糖完全培养基的100mm培养皿中，置37 0C 5%C02培养箱培养，12小时后更换完全培养基去除未贴壁细胞，继续培养。

    取对数生长期RAW264.7细胞，以1 XPBS缓冲液漂洗三遍，0.25%胰蛋白酶消化约2-5分钟，加入适量DMEM高糖完全培养基并以弯枪轻轻吹打细胞离壁，收集细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃上清。以DMEM高糖完全培养基重悬细胞沉淀，按1: 3-1:  6比例传代，24小时换液，72-96小时后再次传代。

4.3细胞计数

    取混匀后的细胞悬液O.lml以1 XPBS缓冲液稀释10倍滴于细胞计数板上，按白细胞计数方法低倍镜下计数四角大方格内细胞数(压线细胞计上不计下，计左不计右)，计数细胞时两次重复计算误差不超过10%}细胞浓度按下面公式计算:

    细胞浓度(?/ml ) =4角大方格内细胞总数/4 X 104、稀释倍数

4.4体外培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞

    将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种在六孔板中，每孔SX10s个细胞，用含10%胎牛血清和90%高糖 DMEM培养至70%融合时进行分组千预。

    正常对照组:常规培养加入DMSO(剂量与LPS+DAPT组相同)培养24小时后，再加入1 XPBS缓冲液(剂量与LPS组相同)继续培养30小时。

    LPS组:常规培养加入DMSO(剂量与LPS+DAPT组相同)培养

24小时后，再加入LPS (100 ng/ml )继续培养30小时。

    LPS+DAPT组:常规培养加入DAFT (10}M)培养24小时后[ys}再加入LPS (100 ng/ml )继续培养30小时。

4.5细胞及上清液的留取:吸取细胞的培养上清液，2500rpm 4℃离心20分钟，取上清，-80℃冰箱保存待用。用预冷的1 XPBS缓冲液洗涤细胞，动作轻柔，以免洗脱细胞。弃去1 XPBS缓冲液，用细胞刮刀刮取细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清。上述操作均在冰上进行。

5方法

5.1 ELISA法测定细胞上清液IL-10 , HMGB 1水平

    检测方法同第一部分血清学指标的ELISA检测，严格按照试剂盒的说明书进行操作。

5.2 Real time-PCR法检测各组RAW264.7细胞中Notchl , Hess mRNA的表达 六孔培养板中每孔细胞加入lml Tirol进行细胞RNA的提取，余同第一部分。

5.3 Western Blot法检测各组RAW264.7细胞中NICD, Hess蛋白的表达六孔培养板中每孔细胞加入200川细胞裂解液提取细胞蛋白，余同

第一部分。

6统计学处理

    应用SPSS 13.0软件处理数据，计量资料以均数士标准差表示，采用单因素方差分析，Student-Newman-Keuls法进行组间比较，双侧P}0.05为差异有统计学意义，P}0.01为有显著统计学意义。相关性分析采用直线相关分析法。

结果

1各组RAW264.7细胞上清液中HMGB 1和IL-10的含量变化

    正常对照组细胞上清液中可检测出低水平的HMGB 1 ( 0.213士0.046dug/L)和IL-10( 59.192士23.304 pg/ml )。经LPS刺激后细胞上清液HMGB 17.441士0.634 }g几)和IL-10 ( 315.188士79.133 pg/ml )水平均有不同程度的升高(P值均<0.01)，其中以HMGB 1升高为主;应用DAPT进行

特异性阻断后，细胞上清液HMGB 1  ( 6 .218士0.711  }g几)和IL-10(252.060士57.633 pg/ml )水平均较LPS刺激组下降明显，以HMGB 1下降最为显著，差异有统计学意义(P值<0.01或<0.05 )(见Fig.l, Table1)。

2 DAPT特异性阻断剂对LPS诱导的RAW264.7细胞内Notch 1 mRNA和Hess mRNA的影响

RAW264.7细胞经LPS刺激后，细胞内Notchl mRNA( 6.493士0.727 )和Hess mRNA ( 7.301士0.851)水平均较正常对照组明显升高(尸值均X0.01);加入DAPT特异性阻断剂进行千预后，与LPS刺激组比较，Notchl mRNA ( 3.203士0.682)和Hess mRNA ( 4.722士0.665)水平显著降低，差异有统计学意义(P值均<0.01)(见Fig.2,  Table 2 )。

3 DAPT特异性阻断剂对LPS诱导的RAW264.7细胞内NICD蛋白和

Hess蛋白的影响

    与正常对照组比较，经LPS刺激的RAW264.7细胞内NICD蛋白 (  0.646士0.100  vs.  0.230士0.071)和Hess蛋白(0.957士0.097  vs.0.542士0.074)水平均明显升高(尸值均<0.01);当应用DAPT特异性阻断剂进行千预后，细胞内NICD蛋白(0.424士0.045)和Hess蛋白

  (  0.838士0.087)水平均较LPS刺激组显著下降，差异有统计学意义(尸值均<0.01)(见Fig.2,  Table 2 )。

4相关性分析

    小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞上清液中HMGB 1水平与Notch 1mRNA, Hess mRNA, NICD蛋白和Hess蛋白均呈正相关，相关系数分别为r=0.849, 0.933, 0.833, 0.866 (P值均<0.01);细胞上清液中IL-10水平也与Notchl mRNA, Hess mRNA, NICD蛋白和Hess蛋白呈正相关，相关系数分别为r=0.798, 0.810, 0.821, 0.834 (P值均<0.01)。讨论

    Notch基因是Morgan及其同事于1919年在果蝇体内首次发现的，该基因的突变可导致果蝇翅膀边缘出现缺口，提示Notch信号通路可能参与组织发育过程「‘6]o Notch信号通路进化上高度保守，主要包括多种受体和配体，且这些受体和配体在不同类型的细胞上结合不同，在不同生物种属中的分布亦不同，如Lag-2是线虫体的配体，蝇体内仅有一个Notch基因和Delta, Serrate两种配体，而在哺乳动物中主要有4种受体(Notch 1-4)和5种配体(Delta-like 1, 3 , 4 , Jagged 1, 2)组成。Notch受体主要包括胞外区、跨膜区、NICD三部分。胞外区的能主要是和配体结合启动Notch信号通路;NICD主要有五部分组成，即与DNA结合蛋白结合的RAM区、Notch信号的增强子、介导Notch与其他蛋白之间相互作用的6个锚蛋白重复序列(ankyrin repeats, ANK )、核定位元信号、翻译启动区和PEST区。经典的Notch信号通路转导过程为:受体与配体结合，Notch信号被激活，此时由GSI水解、酶切Notch的跨膜区，释放NICD进入细胞核，通过ANK重复序列及RAM结构域与核内转录因子RBP-J结合，进一步解离其与SKIP, SMRT等蛋白形成的共抑制复合物，从而启动下游基因，如Hess, Hers家族等碱性螺旋环家族蛋白的表达，发挥多种生物学功能[}m-isl o Hes家族共有6个成员，在Notch

信号通路中发挥作用的主要是Hesl和Hess。与某些信号转导通路不同，在Notch信号的转导过程中第二信使和蛋白激酶未参与其中，激活的Notch信号可直接接受相邻细胞的信号，并传导至胞核，激活细胞内相关转录因子的表达。该方式不能放大细胞信号，对精确调控十分必要。因此，由GSI酶切后进入细胞核的NICD与RBP-J结合是Notch信号通

路转导的关键。DAPT是一种新型GSI抑制剂，可有效减少NICD的产生和Hes家族蛋白的表达，特异性阻断Notch信号转导通路，抑制其发挥重要的生物学作用。

    Notch信号通路已被多项研究证实几乎所有细胞增殖、分化和发育的过程均有其参与Notch信号通路是影响细胞命运的重要信号转导通路，其可通过调节细胞间的接触而达到控细胞转归的目的。例如对果蝇的研究发现，Notch信号通路中存在受体与配体相互制约的正反馈机制，使二者的表达存在细微差别，并在细胞增殖的过程中不断被放大，

最终影响果蝇神经系统的发育[f191。在血管和肿瘤方面，受体Notch4和Delta-like配体在血管组织中高表达，小鼠体内Notch4的缺失或过表达均可导致血管塑性缺陷，Delta-like4的突变或功能缺失也可造成血管重生塑造缺陷和动脉发育异常，甚至可影响胚胎发育导致死亡，提示Notch信号通路异常可致血管发育障碍，需要通过微调触发血管的新生[[20-22]0肿瘤的生长主要依赖肿瘤血管发生过程，其可持续生成新血管来提供氧气、营养以支持正在生长的肿瘤组织。Notch信号通路对已生成的血管影响较小，但与胚胎的血管发生密切相关，因此应用抑制剂作用于该信号通路可有效治疗肿瘤[[23-24]。值得注意的是，抑制剂触发的Notc信号的抑制也可能发生在正常组织中，从而为肿瘤的治疗带来不良反应。有

关心脏发育的研究发现，Notch信号中受体与配体表达异常或RBP-J的突变，可导致心瓣膜发育异常，出现瓣膜的肥大和钙化[}2s-26}。此外，在小鼠体内发现，Notch信号通路还在肝脏、肝外胆管、总胆管和胆囊的发育过程中发挥重要的调控作用[}2}-2s}0    目前对于Notch信号通路的研究已逐步转向免疫系统和炎症方面。体外培养人髓样树突状细胞发现，Jaggedl配体表达上调的幼稚髓样树突状细胞可诱导CD4十T细胞向Th2细胞分化，影响炎症因子的释放[}29}0小鼠体内的浆细胞样树突状细胞表面高表达 Delta-like 4配体，可与Thl细胞表面Notch受体结合，激活胞内Notch信号通路，引起抗炎细胞因子IL-10的大量分泌，从而减轻Thl细胞自身分泌的促炎因子(IL-2, y千扰素、肿瘤坏死因子等)对机体的损害，有助于炎症局限化，是机体的一种自我调节能力[[12, 30]。也有研究发现激活巨噬细胞内Notch信号通路可抑制IL-I O的分泌[[31 ]。联合应用LPS和Y千扰素刺激小鼠骨髓来源的巨噬细胞发现，Notch信号通路的激活可促进炎性因子IL-6的分泌，这一结论在过表达NICD的小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞中也同样得到证实[[32]。此外，Notch信号通路还可与Toll样受体信号协同，促进IL-12,肿瘤坏死因子等炎性因子的分泌[[33]。而与之不同的是最近有研究报道Notch信号通路可通过抑制Toll样受体信号，减少促炎细胞因子的释放，从而减轻由Toll受体触发的炎症反应[[34]。由此可见，免疫细胞内Notch信号通路的激活与炎症关系密切，具体机制不十分明确，尤其是IL-10的分泌与该信号通路的关系尚存在争议。上述报道的与Notch信号通路有关的炎性细胞因子，如IL-6, IL-12、肿瘤坏死因子等，多出现在炎症发生的早期，最近炎症晚期的重要促炎细胞因子HMGB 1也被发现与Notch信号通路有关。此外，在脓毒症的体内和体外实验中均发现，Notch信号通路的激活可促进血管内皮生长因子和HMGB 1的分泌，提高模型小鼠的生存率[}}s}0

    HMGB 1是内毒素血症中重要的晚期炎症介质，属于高迁移率族蛋白家族中的一员，其分布广泛，在多种器官组织的细胞中均有表达，位于细胞核和细胞浆中。核内的HMGB 1是一种移动蛋白，可通过核孔自由穿梭至细胞浆，还可释放到胞外，作为细胞因子发挥多种病理生理效应，参与炎症、肿瘤转移、血管损伤后再狭窄、动脉粥样硬化以及神经细胞轴突生长等过程[36一401 o HMGB 1在脓毒症中的研究较为深入，该病发生的主要机制是感染机体的细菌通过释放LPS激活机体固有免疫系统，使免疫细胞释放多种炎性细胞因子，从而导致机体炎症反应失控，诱发休克和器官功能衰竭，其中内毒素血症是疾病进展的核心环节。HMGB 1是一种延迟性的重要炎性介质，与IL-1、肿瘤坏死因子等早期炎性因子不同，通常在疾病的稍晚期(12-18h)产生，并可以维持较长时间(72h)，是脓毒症晚期的主要致病因素。内毒素血症是急性肝衰竭的主要发病机制之一，因此HMGB 1同样在急性肝衰竭的中晚期同样发挥着举足轻重的作用。

    为了更好的探讨急性肝衰竭发生内毒素血症时，巨噬细胞分泌细胞

因子的分子机制，本研究应用LPS千预体外培养的小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞以模拟内致病环境，同时加入特异性阻断剂DAFT抑制信号传导，观察Notch信号通路相关指标的变化，同时选取与该信号通路有关的晚期致命性重要炎症介质HMGB 1以及尚有争议的IL-10作为反映体内炎症变化的指标。预实验中，我们先加入配成10}M DAPT所需剂量的溶剂DMSO培养细胞至24小时(10 }M DAPT作用细胞24h可完全阻断Notch信号通路[is} )，分别应用long/m1,100ng/m1,1000ng/ml和10000ng/ml浓度的LPS对RAW264.7细胞进行千预，继续观察12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、72小时，结合细胞上清液中HMGB 1, IL-10水平及细胞形态，以第一部分中ALF模型组小鼠血清HMGB 1与IL-10比值作为标准，最终确定LPS为100ng/ml,观察时间为30小时。本研究发现，LPS千预后RAW264.7细胞内Notch 1mRNA, Hess mRNA, NICD蛋白和Hess蛋白水平均明显升高，提示

LPS可激活巨噬细胞内Notch信号转导通路。应用ELISA方法检测出HMGB1, IL-10在正常RAW264.7细胞上清液中有少量表达，加入LPS刺激后二者水平均明显升高，且均与Notch信号通路相关指标呈正比，说明LPS激活巨噬细胞内Notch信号通路可促进HMGB 1, IL-10的分泌。应用10}M DAPT提前千预后发现，以相同剂量的LPS刺激RAW264.7细胞，细胞内Notchl mRNA, Hess mRNA, NICD蛋白和Hess蛋白水平明显下降，表明Notch信号通路被有效抑制，细胞上清液中HMGB 1,IL-10水平亦下降显著，提示二者的分泌与Notch信号通路有关，从而进一步证实Notch信号通路是LPS刺激的巨噬细胞分泌HMGB 1和IL-10的关键调控因素。

    本研究发现LPS激活巨噬细胞内Notch信号通路，一方面可促进HMGB 1的分泌，提示Notch信号通路在内毒素血症发生的晚期发挥着重要作用，其可在前期损伤的基础上进一步加重病情，促使疾病进展;另一方面还可促进IL-10的分泌，减轻炎性因子的致炎作用，抑制炎症反应，改善病情，延缓疾病进展。产生这一看似矛盾结果的原因是机体内存在促炎与抗炎平衡的自我调节机制。众所周知，人体内存在多种平衡，如生长与凋亡、促凝和抗凝、酸碱代谢平衡等，促炎细胞因子和抗炎细胞因子的平衡也是其中之一。正常情况下，体内存在的少量炎性因子和抗炎因子处于动态平衡，不会对机体造成损伤。当遭受刺激时，体内促炎细胞因子分泌增多，这是机体对外界刺激的一种防御性反应。在疾病的初期，促炎细胞因子水平轻度升高。随着外界刺激的持续存在，促炎细胞因子的分泌进一步增加，此时体内抗细胞因子水平也会相应升高，以抵抗炎性因子对机体自身造成的伤害;在疾病的后期，瀑布式

炎症级联反应导致大量炎性因子释放，此时机体分泌的抗炎细胞因子不足以抵抗炎性因子致炎作用，抗炎与促炎平衡被打破，加重组织损伤，最终导致病情恶化。故Notch信号通路的激活既可促进晚期重要炎症介质HMGB 1的分泌，也可促进抗炎细胞因子IL-10的分泌，是机体的一种自我调节机制。本研究中，LPS刺激巨噬细胞内Notch信号通路分泌HMGB 1和IL-10，其中以HMGB 1升高为主，提示在LPS持续升高的晚期，巨噬细胞内Notch信号通路分泌的抗炎因子IL-10不足以抵抗大量释放的HMGB 1的致炎作用，从而对细胞造成损伤。应用DAFT进行阻断后发现，二者水平均明显下降，进一步证实抑制Notch信号通路可减

轻细胞损伤，从而发挥保护作用。

    这也正好解释先前研究出现的争议。原因主要包括以下几点:第一，研究内容只侧重一方面。有些研究仅观察Notch信号通路激活后抗炎细胞因子的变化，如IL-10的分泌，认为Notch信号通路主要发挥抑制炎症的作用;同样有些研究仅观察促炎因子的变化，如IL-6, IL-12, HMGB 1等，认为Notch信号通路主要发挥致炎作用，从而得出截然相反的结论。第二，观察指标不全面。在研究中仅观察早期炎性因子，发现Notch信号通路被抑制后，再用LPS刺激，巨噬细胞内早期炎性因子如IL-6、肿瘤坏死因子等水平升高，而抗炎细胞因子IL-10水平降低，故认为Notch信号通路仅与抗炎有关。第三，忽视炎症是一个连续的动态过程，Notch信号转导通路贯穿炎症发展的整个过程。

    总之，Notch信号通路可调控LPS刺激的巨噬细胞分泌晚期重要炎症介质HMGB 1和抗炎细胞因子IL-10，调节促炎细胞因子和抗炎细胞因子的平衡，参与炎症的发生发展。体外实验中发现，在LPS长期持续刺激下，巨噬细胞以分泌HMGB 1为主，此时分泌的抗炎细胞因子IL-10不足以抵抗HMGB 1的致炎作用，从而导致细胞损伤，加速炎症进展。

当巨噬细胞内Notch信号通路被抑制后，HMGB 1和IL-10的分泌也受到抑制，二者的表达明显下降，进一步证实抑制Notch信号通路可减轻细胞损伤，从而发挥保护作用。这就为临床上有效治疗以炎症为主要病理表现的相关疾病提供新的药物靶点和实验依据。

小结

    1 Notch信号通路具有两面性，其可调控LPS诱导的巨噬细胞同时分泌晚期重要炎症介质HMGB 1和抗炎细胞因子IL-loo

2 LPS长期激活Notch信号通路，可导致HMGB 1分泌相对过多，介导细胞炎症损伤，抑制该信号通路可减轻细胞损伤，发挥保护作用，进一步说明Notch信号通路是LPS致炎的主要分子机制。