益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的调控作用第一部分

王益萍

益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的调控作用

摘要：肝衰竭是多种因素(病毒、药物、肝毒性物质、酒精、遗传代谢性疾

病等引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物益生菌对

急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的调控作用

背景:肝衰竭是多种因素(病毒、药物、肝毒性物质、酒精、遗传代谢性疾病等)引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血功能障碍、黄疽、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。急性肝衰竭(acute liver

failure, ALF )是其中一种亚型，起病急、死亡率高，发病2周内出现II度以上肝性脑病。其发病机制复杂，目前尚不十分清楚。现已明确，肠源性内毒素血症在ALF的疾病进展中发挥着重要作用。内毒素的主要成分为脂多糖(lipopolysaccharide, LPS )，其主要效应细胞是单核巨噬细胞。有学者发现LPS可激活巨噬细胞内Notch信号通路发挥多种生物学功能。目前关于Notch信号通路与炎症关系的研究尚存在争议，尤其是对白介素一10 ( interleukin-10, IL-10)的影响，有研究显示Notch信号通路可促进IL-10的分泌，但也有研显示其可抑制IL-10的分泌。此外，最近研究发现LPS激活巨噬细胞Notch信号通路与晚期炎症介质高迁移率族蛋白B 1 ( high mobility group protein B 1, HMGB 1)的分泌有关。HMGB 1是内毒素血症中重要的晚期炎症介质，推测HMGB 1在ALF的进展中也发挥着举足轻重的作用。目前，临床上应用益生菌辅助治疗肝病患者已取得很好的疗效，其可以通过调节肠道菌群失调，降低肠道内毒素的产生和吸收，减少血液循环中内毒素的含量，从而改善内毒素血症，对受损的肝脏起保护作用。但对其具体的作用机制尚不明确，且缺乏相关研究。肝衰竭死亡率高，虽然肝移植是最有效的治疗方法，但肝源奇缺、费用昂贵的矛盾仍非常突出。因此肝衰竭的预防显得尤为重要。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是目前仅次于病毒性肝炎的第二大肝病病因，NAFLD患者比健康人群更易进展为肝衰竭。早期诊断和治疗NAFLD，可在一定程度上预防肝衰竭的发生。非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)是NAFLD疾病进展的重要限速步骤，因此NASH的早期诊断已成为肝衰竭的主要防治工作之一。

     目的:本研究通过腹腔注射D-氨基半乳糖建立小鼠ALF模型，并应用益生菌千预模型小鼠，通过检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase, ALT )，天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、IL-10 , HMGB 1及血浆LPS水平，肝组织内Jaggedl , Notchl ,Hess mRNA和蛋白、NICD蛋白以及巨噬细胞活化标记物CD68的表达，同时行肝组织病理染色，观察益生菌千预后肝组织病理改变，以及LPS,IL-10 , HMGB 1与Notch信号通路相关指标的表达变化及意义;体外培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，应用LPS和Notch信号通路的特异性阻断剂氮一[氮一((3,  5一二氟苯乙酞)-L一丙氨酞}一S一苯基甘氨酸丁酷(N一【N一(3, 5一difluorophenacetyl一一S一phenylglycinet一butyl ester, DAPT)进行千预，观察细胞上清液IL-10 , HMGB 1水平和细胞内Notch信号通路相关指标的表达变化，明确Notch信号通路在外源性LPS刺激巨噬细胞分泌细胞因子中的调控作用;同时应用正常小鼠血浆、ALF小鼠血浆和益生菌千预小鼠血浆分别刺激小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，观察细胞上清液LPS, IL-10, HMGB1水平和细胞内Notch信号通路相关指标的表达变化，从整体、组织、细胞及分子水平探讨益生菌对于ALF的可能作用机制，为临床应用益生菌预防ALF提

供新的理论基础和实验依据。此外，还通过检测NAFLD患者血清中与NAFLD发病密切相关的指标变化，应用统计学方法进行分析处理，建立NASH的无创诊断模型，从而为NASH的早期诊断，也为肝衰竭的预防提供新思路。

    方法:

1益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的影响

   健康清洁级6-8周龄雄性BALB/c小鼠30只，体重(18-20 ) g，由河北医科大学动物实验中心提供。用标准饲料适应性喂养1周，随机分为以下三组:a正常对照组10只:标准饲料喂养;b ALF模型组10只:标准饲料喂养，给予生理盐水(与益生菌千预组剂量相同)灌胃2周，

于2周末腹腔注射3 .Og/kg的D-氨基半乳糖(以生理盐水溶解，浓度为60mg/ml );c益生菌千预组10只:标准饲料喂养，给予益生菌(金双歧)900mg/kg/d(生理盐水配成100mg/ml混悬液)灌胃2周，于2周末腹腔注射3.Og/kg的D-氨基半乳糖(以生理盐水溶解，浓度为60mg/ml ) o

于腹腔注射3.Og/kg D-氨基半乳糖(造模)36小时处死全部小鼠，留取血清、血浆及肝组织。应用全自动生化分析仪测定血清ALT, AST水平;应用酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法测定血清IL-10 , HMGB 1水平;赏试剂盒检查血浆LPS水平;取部分肝组织以10%中性甲醛溶液固定，用于常规苏木素一伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerasechain reaction, real time-PCR)法检测小鼠肝组织Jaggedl , Notchl和HessmRNA的表达;Western Blot法检测小鼠肝组织Jaggedl , Notchl , NICD和Hess蛋白的表达变化;免疫组织化学染色方法检测小鼠肝组织CD68

的表达。

2 Notch信号通路在脂多糖刺激巨噬细胞分泌细胞因子中的调控作用

    小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种在六孔板中，每孔5X105个细胞，用含10%胎牛血清和90%高糖DMEM培养至70%融合时进行分组千预。正常对照组:常规培养加入DMSO(剂量与LPS+DAPT组相同)培养24小时后，再加入1 XPBS缓冲液(剂量与LPS组相同)继续培养30小时; LPS组:常规培养加入DMSO(剂量与LPS+DAPT组相同)培养24小时后，再加入LPS (100 ng/ml )继续培养30小时;LPS+DAPT组:常规培养加入DAPT (10 }M)培养24小时后[ys}，再加入LPS (100 ng/ml )继续培养30小时;收取细胞及上清液。ELISA法测定细胞上清液IL-10 , HMGB 1水平;Real time-PCR法检测RAW264.7细胞Notchl , Hess mRNA的表达;Western Blot法检

测RAW264.7细胞NICD, Hess蛋白的表达变化。

3益生菌千预小鼠血浆调控巨噬细胞分泌细胞因子的分子机制

    将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种在六孔板中，每孔5X105个细胞，用含10%胎牛血清和90%高糖DMEM培养至70%融合时进行分组千预。正常小鼠血浆千预组:80%细胞完全培养基(10%胎牛血清+90%高糖DMEM) +20%正常小鼠血浆培养48小时;ALF小鼠血浆千预组:80%细胞完全培养基(10%胎牛血清+90%高糖DMEM) +20%ALF小鼠血浆培养48小时;益生菌千预小鼠血浆千预组:80%细胞完全培养基(10%胎牛血清+90%高糖DMEM) +20%益生菌千预小鼠血浆培养48小时;收取细胞及上清液。ELISA法测定细胞上清液IL-10 , HMGB 1和

LPS水平;Real time-PCR法检测血浆千预RAW264.7细胞Jaggedl,Notchl , Hess mRNA的表达;Western Blot法检测血浆千预RAW264.7细胞Jaggedl , Notchl , NICD, Hess蛋白的表达。

4细胞角蛋白18、天冬氨酸氨基转移酶、血小板、甘油三酷联合预测非

酒精性脂肪性肝炎的发生

    入选患者均需行肝活检，诊断符合中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组制定的非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)，同时排除酒精性脂肪性肝病((5年内乙醇摄入量男性>40克/天或女性>20克/天)或过量饮酒(男性乙醇摄入量>140克/周或女性>70克/周);病毒性肝炎;自身免疫性肝病;药物或毒物诱导的肝损害;遗传代谢性疾病(Wilson's病、血色素沉着症、al抗胰蛋白酶缺乏症等);胆道梗阻。根据肝组织病理学检查结果，将所有纳入的研究对象分为两组，即非-非酒精性脂肪性肝炎组(non-nonalcoholic steatohepatitis, non-NASH)和NASH组。计算患者体重指数、腰臀比;询问是否合并糖尿病、高血压、血脂异常及吸烟习惯;检测血清ALT, AST、总胆红素(total bilirubin,TB )、白蛋白(albumin, ALB )、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP ) ,Y_谷氨酞转肤酶(y-glutamyl transpeptidase, y-GT )、国际标准化比率

  (  international normalized ratio, M )、血小板、白细胞(white blood cell,WBC )、肌配、尿酸(Uric acid, UA )、空腹血糖(fasting glucose, FG )、甘油三酷(triglycerides, TG )，胆固醇(total cholesterol, TC )、血红蛋白、超敏反应蛋白(hs-Creactive protein, hs-CRP)和铁蛋白水平;ELISA

法测定血清细胞角蛋白18 ( cytokeratin 18, CK 18 )凋亡片段M30的水平。

    实验数据以x士s表示，单因素方差分析前进行正态性及方差齐性检验Least-Significant-Difference法进行组间比较，双侧P}0.05为差异有统计学意义，P}0.01为有显著统计学意义。相关性分析采用直线相关分析法。应用SPSS 13.0统计软件分析实验数据。

    结果:

1益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的影响

1.1小鼠的一般情况:正常对照组小鼠精神状态良好，食欲旺盛，对外界刺激或痛觉反应正常;ALF模型组小鼠精神萎靡，进食减少，动作迟缓，对外界刺激反应减弱;益生菌千预组小鼠精神、食欲及对界外刺激反应介于正常对照组与ALF模型组之间。

1.2小鼠生化指标、血清HMGB 1, IL-10及血浆LPS水平变化:ALF模型组小鼠血清ALT ( 848.404士94.828 U/L ) , AST ( 911.490士67.652 U几)、HMGB 1(101.909士12.428 }g/L)、IL-10 (4627.884士842.453 pg/ml)和血浆LPS (11.801士0.887 EU/ml)水平均高于正常对照组(38.994士9.628U几、55.279士7.499 U几、20.733士5.369 }g几、1064.924士238.455 pg/ml、

0.578士0.119 EU/ml )(尸值均<0.01 );而益生菌千预组血清ALT(689.891士84.649  U/L)、AST(776.026士61.892  U/L)、HMGB 1(82.556士9.719 }g/L )、IL-10 ( 3182.596士769.235 pg/ml)和血浆LPS (  7.396士0.919 EU/ml )水平均较ALF模型组明显降低(尸值均<0.01)。

1.3肝组织病理学变化:光镜下，HE染色可见正常对照组小鼠肝组织内大小一致的肝细胞围绕肝小叶中央静脉呈放射状分布，肝细胞排列整齐，肝索结构完整;ALF模型组小鼠肝组织正常结构被破坏，肝索结构紊乱，可见大面积肝细胞坏死及大量炎性细胞浸润，残存肝细胞肿胀，呈气球样变;益生菌千预组小鼠肝细胞坏死、变性及炎性细胞浸润程度均较ALF模型组改善。1.4肝组织Jaggedl , Notchl , Hess mRNA和蛋白、NICD蛋白的表达:ALF模型组小鼠肝组织内Jaggedl , Notchl , Hess mRNA和蛋白、NICD蛋白的表达量均较正常对照组明显增加(P值均<0.01);而益生菌千预组上述指标的表达水平均较ALF模型组明显减少，差异有统计学意义(P值均<0.01或<0.05)。1.5肝组织CD68蛋白的表达:ALF模型组小鼠肝组织CD68蛋白(0.631士0.067 }m2)较正常对照组(0.339士0.071 }m2)明显增加(尸X0.01) ;与ALF模型组比较，益生菌千预组CD68蛋白表达量(0.460士0.094 }m2 )明显减少(P}0.01)。

1.6相关性分析

小鼠血浆LPS水平与ALT, AST, Jaggedl mRNA, Notchl mRNA,Hess mRNA, Jaggedl蛋白、Notch 1蛋白、NICD蛋白、Hess蛋白、血清HMGB 1, IL-10水平及肝组织CD68蛋白的表达水平均呈正相关，相关系数分别为r=0.936, 0.946, 0.947, 0.945, 0.948, 0.894, 0.829, 0.926,0.907, 0.942, 0.900, 0.973 (P值均<0.01)。2 Notch信号通路在脂多糖刺激巨噬细胞分泌细胞因子中的调控作用

2.1 RAW264.7细胞上清液中HMGB 1和IL-10的含量变化:正常对照组细胞上清液中可检测出低水平的HMGB 1 ( 0 .213士0.046 }g几)和IL-10(59.192士23 .304 pg/ml )。经LPS刺激后细胞上清液HMGB 1( 7 .441士0.634dug/L)和IL-10 ( 315.188士79.133 pg/ml )水平均有不同程度的升高(尸值均<0.01)，其中以HMGB 1升高为主;应用DAPT进行特异性阻断后，细胞上清液HMGB 1( 6 .218士0.711 }g几)和IL-10 ( 252.060士57.633 pg/ml )水平均较LPS刺激组下降明显，以HMGB 1下降最为显著，差异有统计学意义(P值<0.01或<0.05 )。

2.2 DAPT特异性阻断剂对LPS诱导的RAW264.7细胞Notch 1 mRNA,Hess mRNA和蛋白、NICD蛋白的影响:RAW264.7细胞经LPS刺激后，细胞内Notchl mRNA, Hess mRNA和蛋白、NICD蛋白水平均较正常对照组明显升高(P值均<0.01);加入DAPT特异性阻断剂进行千预后，与LPS刺激组比较，上述指标的表达水平均显著降低，差异有统计学意义(P值均<0.01)。

2.3相关性分析

    小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞上清液中HMGB 1水平与Notch 1mRNA, Hess mRNA, NICD蛋白和Hess蛋白均呈正相关，相关系数分别为r=0.849, 0.933, 0.833, 0.866 (P值均<0.01);细胞上清液中IL-10水平也与Notchl mRNA, Hess mRNA, NICD蛋白和Hess蛋白呈正相关，相关系数分别为r=0.798, 0.810, 0.821, 0.834 (P值均<0.01)。3益生菌千预小鼠血浆调控巨噬胞分泌细胞因子的分子机制

3.1小鼠血浆千预RAW264.7细胞上清液中HMGB 1, IL-10和LPS的含量变化:正常小鼠血浆千预组细胞上清液中HMGB 1( 3 .433士0.674 }g几)·IL-10 ( 286.524士33.507 pg/ml)和LPS( 0.090士0.014 EU/ml)水平较低;ALF小鼠血浆千预组细胞上清液中HMGB 1 ( 34.691士9.058雌几), IL-10  (1812.736士185.574 pg/ml)和LPS (2.102士0.121 EU/ml)水平则较正常

小鼠血浆千预组明显升高，差异有统计学意义(P值均<0.01);与ALF小鼠血浆千预组比较，益生菌千预小鼠血浆千预组细胞上清液HMGB 1(20.058士2.278  }g/L)、IL-10(1338.322士151.339  pg/ml)和LPS (1.220士0.069 EU/ml )水平均明显下降(尸值均<0.01)。

3.2小鼠血浆千预RAW264.7细胞内Jaggedl , Notchl , Hess mRNA和蛋白、NICD蛋白的表达变化:RAW264.7细胞经ALF小鼠血浆千预后，细胞内Jaggedl , Notchl , Hess mRNA和蛋白、NICD蛋白水平均较正常小鼠血浆千预组明显升高(P值均<0.01);加入益生菌千预小鼠血浆后，与ALF小鼠血浆千预组比较，上述指标表达水平显著降低，差异有统计学意义(P值均<0.01)。

3.3相关性分析

    小鼠血浆千预RAW264.7细胞上清液LPS水平与Jaggedl mRNA,Notchl mRNA, Hess mRNA, Jaggedl蛋白、Notch 1蛋白、NICD蛋白、Hess蛋白、细胞上清液HMGB 1和IL-10水平均正相关，相关系数分别为r=0.969, 0.911, 0.955, 0.931, 0.889, 0.937, 0.940, 0.913, 0.965  (P值均<0.01)。

4细胞角蛋白18、天冬氨酸氨基转移酶、血小板、甘油三酷联合预测非酒精性脂肪性肝炎的发生

4.1人口学及实验室指标的变化:Non-NASH组和NASH组患者年龄、性别构成比、吸烟习惯、糖尿病、高血压、血脂异常、收缩压、舒张压、血清TB, WBC、血红蛋白、肌配、M, FG, TC和铁蛋白水平差异均无统计学意义(均P>0.05 )，而NASH患者BMI, WHR、血清AST,ALT, ALP, y-GT, UA, hs-CRP, TG和血小板水平均较non-NASH组明显升高，血清ALB水平则明显降低(均P}0.05 )。

4.2血清CK 18片段M30水平及其与肝组织病理学特征的相关性分析:

    NASH组患者血清CK 18片段M30水平(372.9U/L ( 319.6, 431.4 ))较non-NASH组(248.1U/L ( 237.5, 266.6 ))明显升高(P}0.001)。其与肝组织脂变(r=0.492 )、气球样变(r=0.211)、汇管区症(r=0.346 )和纤维化分级(r=0.407 )均成正相关(P}0.05或P}0.01)。

4.3多变量分析:体重指数、腰臀比、血清AST, ALT, ALP, ALB, y-GT, UA, hs-CRP, TG, CK-18片段M30及血小板均纳入多变量模型分析。其中ALT、血小板、CK-18片段M30和TG是NASH的预测因

素。四个指标的AUROC分别为0.811 ( 95% CI: 0.722-0.899 )、0.631  } 95% CI: 0.515-0.746 )、0.892 ( 95% CI: 0.824-0.960)和0.714 ( 95%CI: 0.611-0.818 )。其中血清CK-18片段M30水平与ALT (r=0.639)和TG (r=0.390)水平均成正相关(均P}0.05 )，而与血小板无相关性  (P>0.05)。4.4 NASH预测模型ogistic回归分析得出NASH预测模型，具体公式为一12.764+0.075 XALT ( U/L ) +0.013、血小板(X 109/L ) +0 . 012 X CK-18片段M30 ( U/L ) +0.006 X TG ( mg/dL )。该模型的AUROC为0.920 ( 95%CI: 0.866-0.974 )，临界值为0.361，敏感性、阳性预测值和阴性预测值均为89%，特异性为86% o

    结论:

    1应用D-氨基半乳糖腹腔注射小鼠可以成功复制ALF模型，其中血浆LPS水平的升高在ALF的发生发展中起着重要作用。

    2 ALF小鼠血浆中升高的LPS可使肝组织内巨噬细胞活化，激活细胞内Notch信号通路，促进晚期重要炎症介质HMGB 1和抗炎细胞因子IL-10的分泌，其中以升高HMGB 1为主，参与肝脏的炎症损伤过程，加速ALF的疾病进展。

    3益生菌可通过降低ALF小鼠血浆LPS水平，减少肝组织中巨噬细胞的活化，抑制Notch信号转导，降低HMGB 1和IL-10的水平，从而发挥保护肝脏的作用，为临床预防ALF提供了新的思路和方向。

    4由CK-18, ALT、血小板和甘油三酷组成的无创诊断模型可准确预测NASH的发生，该模型可能在延缓NAFLD病情进展，改善患者预后及预防肝衰竭中发挥一定作用。

    关键词:急性肝衰竭;脂多糖;Notch信号通路;高迁移率族蛋白B1;白介素10;益生菌

益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的调控作用

引言

    急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)是指发病2周内出现以II度以上肝性脑病为特征的肝衰竭症候群，起病急、死亡率高、预后极差。它是肝衰竭的一种亚型，发病机制复杂，迄为止尚未完全阐明。一般认为急性肝衰竭的发病机制主要经历三个阶段:第一阶段是病毒、损肝药物、肝毒性物质等致病因素对肝细胞的直接损伤作用，致使肝脏功能轻度受损，此时去除致病因素，肝功能即可恢复;第二阶段是致病因素的持续存在诱发的机体免疫反应，造成肝细胞坏死以及大量炎性细胞浸润，肝脏功能明显受损;第三阶段是随着肝脏功能受损程的加重，肝脏解毒能力下降，此时肠道菌群失调，肠道屏障功能遭到破坏，最终造成肠源性内毒素血症的发生。此时肝脏与肠道相互作用，形成恶性循环，进一步加速肝细胞死亡。由此可见，肠源性内毒素血症在ALF的疾病进展中发挥着重要作用。

    内毒素的主要成分为脂多糖(lippolysaccharide, LPS )，其主要效应细胞是单核巨噬细胞有学者发现LPS可激活巨噬细胞内Notch信号通路发挥多种生物学功能。Notch信号通路进化上高度保守，主要包括4种受体(Notch 1-4)和5种配体(Delta-likel,  3, 4, Jaggedl, 2)。经典的Notch信号通路转导过程为:受体与配体结合，Notch信号被激活，

此时由Y_分泌酶(y-secretes, GSI )水解、酶切Notch的跨膜区，释放受体胞内段(notch intracellular domain, NICD)进入细胞核，通过ANK重复序列及RAM结构域与核内转录因子RBP-J结合，进一步解离其与SKIP, SMRT等蛋白形成的共抑制复合物，从而启动下游基因，如Hes(Hes 1, Hess )、HesR家族等碱性螺旋环家族蛋白的表达，发挥生物学效应。目前关于Notch信号通路与炎症关系的研究尚存在争议，尤其是对白介素一10 ( interleukin-10, IL-10的影响，有研究显示Notch信号通路可促进IL-10的分泌，但也有研究显示其可抑制IL-10的分泌。此外，最近研究发现LPS激活巨噬细胞Notch信号通路与晚期炎症介质高

迁移率族蛋白B 1 ( high mobility group protein B 1, HMGB 1)的分泌有关。HMGB 1是内毒素血症中重要的晚期炎症介质，在多种器官组织的细胞中均有表达，位于细胞核和细胞浆中。HMGB 1是一种延迟性的重要炎J陛介质，与白介素1、肿瘤坏死因子等早期炎性因子不通常在疾病的稍晚期(12-18小时)产生，并可以维持较长时间((72小时)，是疾病后期的主要致病因素，推测HMGB 1在ALF的进展中也发挥着举足轻重的作用。

    在临床上，直接有效降低血浆内毒素水平的药物是微生态制剂，是运用微生态学原理，利用对宿主有益无害的益生菌或益生菌的促生长物质，经特殊工艺制成的制剂。目前，临上应用微生态制剂辅助治疗肝病患者已取得很好的疗效，其可以通过调节肠道菌群失调，降低肠道内毒素的产生和吸收，减少血液循环中内毒素的含量，从而改善内毒素血症，对受损的肝脏起保护作用。但对其具体的作用机制尚不明确，且缺乏相关研究。

肝衰竭治疗的首选方案是肝移植，但其在临床中的应用受到一定的限制。目前内科保守治疗仅是改善病情，延缓疾病进展，延长生存时间，提高患者接受外科肝移植手术的几率，并不能从根本上治愈疾病。因此相对于肝衰竭的治疗而言，肝衰竭的预防显得尤为重要。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是目前仅次于病毒性肝炎的第二大肝病病因，已成为主要的社会公共卫生问题。当遭受损肝因素持续刺激时，NAFLD患者比康人群更易进展为肝衰竭。早期诊断NAFLD同时结合及时有效的治疗，在一定程度上将有助于延缓疾病进展，提高患者生存质量，预防肝衰竭的发生。非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)是NAFLD疾病进展的重要限速步骤，因此NASH的早期诊断已成为肝衰竭的防治重点之一。

第二章

益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的影响

前言

    肝衰竭是多种因素(病毒、药物、肝毒性物质、酒精、遗传代谢性疾病等)引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血功能障碍、黄疽、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。根据病理组织学特征和病情发展速度，肝衰竭可分为四类:ALF、亚急性肝衰竭、‘漫加急性(亚急性)肝衰竭和慢

性肝衰竭[m。急性肝衰竭起病急、死亡率高、预后极差，发病2周内出现II度以上肝性脑病。其发病机制极其复杂，迄今为止尚未阐明。现已明确肠源性内毒素血症在疾病进展中发挥重要作用。

    肝脏是体内清除内毒素和解毒的主要脏器，也是遭受内毒素攻击的首要器官。研究发现70 %-100%肝衰竭患者均存在内毒素血症，它已成为肝衰竭患者高死亡率的主要原因。在正常情况下，体循环内无内毒素，只有少量存在于肠道内。肝衰竭患者存在肠道菌群失调，肠杆菌科细菌过度生长，肠道屏障功能受损，导致肠道菌群移位，内毒素产生增加，而此时肝脏巨噬细胞功能减弱，对内毒素灭活功能降低，最终造成内毒素血症。内毒素的主要效应细胞是单核一巨噬细胞，抗原分子CD68是巨噬细胞活化的特异性表面标记。内毒素可激活肝脏内大量巨噬细胞，诱生各种炎性相关细胞因子，这些细胞因子发生级联反应进一步加重肝损伤，形成肝肠恶性循环。

    内毒素的主要成分为LPS。近年来在免疫领域的研究中发现LPS可激活T淋巴细胞、单核一巨噬细胞、树突细胞中Notch信号通路，参与细胞增殖、凋亡，影响细胞因子分泌[2-4]。在哺乳动物中，经典的Notch信号通路由位于细胞膜上的5种配体(Jaggedl , 2, Delta-like 1, 3 , 4)和4种受体  (  Notch 1-4)组成，当配体与受体结合时，Notch信号通路即被激活，在细胞浆内GSI的酶切作用下，NICD被剪切入核，与核内转录因子RBP-J结

合，启动下游基因如Hess家族的表达，引发后续分子事件[}s}。已有研究发现，LPS激活巨噬细胞Notch信号通路可促进晚期炎症介质HMGB 1的分泌[6]。最新研究又发现，激活的Notch信号通路还可发挥抗炎作用，与IL-10密切相关降。因此，LPS通过激活巨噬细胞Notch信号通路发挥何种生物学功能仍存在争议。

    微生态制剂也叫活菌制剂或生菌剂，是指运用微生态学原理，利用对宿主有益无害的生菌或益生菌的促生长物质，经特殊工艺制成的制剂。微生态制剂包括益生菌、益生元和合元。临床上应用益生菌辅助治疗肝病患者已取得很好的疗效，其可以通过调节肠道菌群失调，降低肠道内毒素的产生和吸收，减少血液循环中内毒素的含量，从而改善内毒素血症，对受损的肝脏起保护作用。但目前益生菌对肝脏的保护作用是否与Notch信号通路有关尚不明确，且缺乏相关研究。

本实验通过腹腔注射D-氨基半乳糖制备ALF小鼠模型，并提前应用益生菌一双歧杆乳杆菌三联活菌(金双歧)给予小鼠灌胃2周，于造模后36小时处死各组小鼠取血清、血浆和肝组织，以做生化指标、IL-10,HMGB 1,  LP S的检测，应用实时荧光定量聚合酶链反应(real-timequantitative polymerase  chain reaction, real time-PCR)的方法测定Jaggedl , Notchl和Hess mRNA在小鼠肝组织中的表达，蛋白印记法Western Blot检测小鼠肝组织Jaggedl , Notchl , NICD和Hess的蛋白表达，并采用免疫组化(immunohistochemical, IHC)染色方法检测巨噬细胞活化标记物CD68蛋白[9]在肝组织中的表达，旨在探讨益生菌对ALF发挥保护作用的分子机制。

材料与方法

1仪器设备

全自动生化分析仪AU-2700     日本Olympus公司

紫外分光光度计2000C         美国Thermo公司

Real time PCR仪ABI 7500       美国ABI公司

脱水机TP1020                德国Lexica公司

轮转石蜡切片机RM-2135      德国Lexica公司

倒显微镜DM500                  德国Lexica公司

要试刑的配制

4.1 O.O1M构椽酸盐缓冲液(pH=6.0 ):A液9m1, B液41m1，蒸馏水450m1 o A液:O.1M构椽酸溶液:构椽酸(C6HgO}}H20) 20.01g，蒸馏水定容至1 OOOmI o B液:O.1M构椽酸钠溶液:构椽酸钠(C6HSNa30}}2H20 )29.41 g，蒸馏水定容至1 OOOmI o4.2 1 XPBS缓冲液:NaC118.5g, Na2HP04}12H20 2.901g, NaH2P04}2H202.964g，双蒸水定容至1 OOOmI o4.3 10%过硫酸铰液:O.lg过硫酸铰，溶于lml蒸馏水中，4℃保存(最长不应超过1周)。4.4 SXTris一甘氨酸泳缓冲液:先用15.1g Tris碱和94g甘氨酸，10% SDSSOmI，加蒸馏水至1000m1，配成5 XTri一甘氨酸电泳缓冲液储存液，常温保存，用时稀释成1 XTris一甘氨酸电泳缓冲液。4.5转膜缓冲液:0.58g Tris碱、0.29g甘氨酸、SDS 37林1和20m1甲醇，加蒸馏水至100m1,  4℃避光保存，现用现配。

4.6 lOXTBST缓冲液:先用8.77g NaCl,  lOml 1M Tris-HCl (PH 8.0 )、200u1 Tween20，加蒸馏水至100m1, 4 0C保存，用时稀释成1 XTBST缓冲液。

4.7 30%丙烯酞胺溶液:29g丙烯酞胺和1g亚甲双丙烯酞胺溶于100m1蒸馏水中，4℃避光保存。

4.8 10% SDS溶液:lOg SDS溶于50 0C 1 OOmI蒸馏水中，充分溶解，常温避光保存。

4.9封闭液:1g脱脂奶粉，加20m1 1 XTBST缓冲液溶解。

4.10 DEPC水:lml焦炭酸二乙酷(diethypyrocarbonate, DEPC)加999 ml双蒸水中，静置4小时后备用。

4.11 75%冰乙醇EPC水与无水乙醇按体积比1:3配制，4℃保存。

4.12显影液:大袋2.5g，小袋0.225g，加水至SOmI,  50 0C充分溶解。

4.13定影液:定影粉6.25g溶于SOmI蒸馏水中。

5方法

5.1 ALF小鼠动物模型的建立

    健康清洁级6-8周龄雄性BALB/c小鼠30只，体重(18-20 ) g，由河北医科大学动物实验中心提供。分笼饲养，每笼5只，按昼夜时程，在室温及稳定湿度条件下，用标准饲料适应性喂养1周，随机分为以下

三组:

    a正常对照组10只:标准饲料喂养

    b ALF模型组10只:标准饲料喂养，给予生理盐水(与益生菌千预组剂量相同)灌胃2周，于2周末腹腔注射3.Og/kg的D-氨基半乳糖(以

生理盐水溶解，浓度为60mg/ml )

    c益生菌千预组10只:标准饲料喂养，给予益生菌(金双歧)900mg/kg/d(生理盐水配成100mg/ml混悬液)灌胃2周，于2周末腹腔注射3.Og/kg的D-氨基半乳糖(以生理盐水溶解，浓度为60mg/ml )

    于腹腔注射3.Og/kg D-氨基半乳糖(造模)36小时处死全部小鼠。各组小鼠处死前，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，眼球取血，采集血清、血浆。留取小鼠肝组织，部分肝组织以10%中性甲醛溶液固定，用于普通病理、免疫组化染色，余下部分迅速置于液氮，-80℃保存，用于realtim e-PCR和Western Blot的检测。

5.2观测指标与方法

5.2.1生化指标

    用日本Olympus AU2700全自动生化分析仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT )，天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase, AST)水平。

5.2.2血清IL-10 , HMGB 1及血浆LPS水平

    应用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法测定血清IL-10 , HMGB 1水平。

    IL-10的检测步骤:

      (1)将所有的试剂、样本平衡至室温。

    (2) 300川洗液洗版两次，加入300川洗液静置浸泡15分钟。弃掉洗液后，在吸水纸上将微孔板拍千。洗板完成之后，立即使用微孔板，不要让微孔板千燥。

    (3)每孔加入501样本稀释液。

    (4)加入50川的标准品，样本和对照品。保证连续加样，勿间断，加样过程在15分钟内完成。

    (5)每孔加入501待测抗体。

      (6)使用封板膜封板，100转/分钟振荡，室温孵育2小时。

    (7)弃掉液体，每孔加入300川洗液洗板，洗涤6次。每次洗板，在吸水纸上拍千，需彻底移除残留液体。

    (8)每孔加入100川辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

      (9)使用新的封板膜封板。100转/分钟振荡，室温孵育45分钟。

      (10)重复步骤(7)。

    (11)每孔加入100川显色底物TMB，避光，室温孵育10-30分钟。

    (12)每孔加入100川终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，需轻轻叩击板框，充分混匀。

      (13)在30分钟内，酶标仪450nm波长测定OD值，计算样本浓度时乘以稀释因子20

  HMGB 1的检测步骤:

      (1)标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100川，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50川，混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100川分别加入到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50川，混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50川弃掉，再各取50川分别加入到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50川，混匀;然后从第五、第六孔中各取50川分别加入到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50川，混匀后从第七、第八孔中分别取50川加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔中分别加标准品稀释液50川，混匀后从第九、第十孔中各取50川弃掉。(稀释后各孔加样量均为50川，浓度分别为12 }g/L,  8}g/L,   4}g/L,  2}g/L,  1 }g/L )。

      (2)加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40川，然后加待测样品10川(样品最终稀释度为5倍)。加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

      (3)温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

      (4)酉己液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

      (5)洗涤:小臼揭掉封板膜，弃去液体，甩千，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍千。

    (6)加酶:每孔加入酶标试剂50川，空白孔除外。

      (7)温育:操作同((3)。

      (8)洗涤:操作同((5)。

    (9)显色:每孔先加显色剂A 50川，再加入显色剂B 50川，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

    (10)终止:每孔加终止液50川，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

      (11)测定:以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

    血浆内毒素应用赏试剂显色基质法进行测定，具体步骤为:

      (1)酉己制细菌内毒素标准溶液，4小时用完。

      (2)阴性对照为细菌内毒素检查用水。

      (3)赏试剂、显色基质、偶氮化试剂的溶解，4℃贮存，1周内用七乡夕口。

    (4)取无热原试管，加入50川细菌内毒素检查用水、内毒素标准

溶液，或供试品。再加入50川赏试剂溶液，混匀，37℃温育T1分钟。温育结束，加入50川显色基质溶液，混匀。37℃温育T2分钟。温育结束，加入250川偶氮化试剂1溶液，混匀。加入250川偶氮化试剂2溶液，混匀。加入250川偶氮化试剂3溶液，混匀，静置5分钟，于545nm波长处读取吸光度值。(上述T1及T2见赏试剂出厂检验报告)

      (5)数据处理。建立标准曲线:Y=bX+a，其中Y为545nm处吸光度值，X为内毒素的浓度，b为直线斜率，a为Y轴截距。5.2.3普通病理学检查10%福尔马林固定标本，经80%, 90%, 95%, 100%梯度酒精脱水各2小时，二甲苯透明4小时，浸蜡后，将肝组织切成小块包埋制成石蜡块，连续5 hum厚切片，将切下的组织裱于千净的载玻片上，37℃烤千后，72℃烤片3小时。常规苏木素一伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察肝组织普通病理变化，具体二甲苯脱蜡3次，10分钟/次，经100%,95%, 75%酒精、蒸馏水梯度水化各2分钟，苏木素染色15分钟，自来水洗5秒，0.5%盐酸乙醇分化15秒，于40℃温水中返蓝，伊红染色10分钟，二甲苯透明5分钟，中性树胶封片后光镜下观察，用多功能病理图象分析仪分析图像。

5.2.4 Real time-PCR法检测小鼠肝组织Jaggedl , Notchl和Hess mRNA的表达，具体方法如下:

    肝组织总RNA采用Tirol一步法提取:取液氮保存肝组织100mg,剪碎，加入1 ml Tirol匀浆后转入O.SmI离心管中，室温放置5分钟，使其充分裂解。12000rpm离心15分钟，弃沉淀。加入200林1氯仿，振荡混匀后室温放置15分钟。4 0C 12000rpm离心10分钟，小臼吸取上层水相，加入O.SmI异丙醇混匀，-20 0C过夜。4 0C 12000rpm离心10分钟，弃上清，RNA沉于管底。加入lml 75%乙醇，温和振荡离心管悬浮沉淀。4 0C 7600rpm离心5分钟，弃上清。室温晾千5-10分钟。加入50林1 DEPC水溶解。取适量RNA在紫外分光光度仪上测定RNA样品260nm与280nm处的吸光度(OD)值，空白对照为不含RNA的DEPC水。定量

RNA浓度(dug/}ul ) o RNA纯度以OD260/OD280比值表示，OD260/OD280

应在1.8以上，说明蛋白质污染少。选择oD26oioD28o比值为1.82.0的RNA用作逆转录。样品于一80℃冰箱内保存待用。

    cDNA的合成:依照Nitrogen逆转录试剂盒说明书进行，依据所测RNA浓度在1}g的RNA中加入Oligo(dT)2o 1 } },1, DEPC水1 }1混合后，65℃加热5分钟后迅速置于冰上冷却，短暂离心后依次加入5、第一链合成缓冲液4川、DTT 2川、RNA酶抑制剂1川，混匀，37 0C孵育2分钟，加M-ML V逆转录酶1 }1，轻轻吹打混匀，加DEPC水至终体积为201,37 0C孵育50分钟，70℃加热15分钟以灭活剩余的M-ML V，即可得到逆转录产物cDNA。将产物置于一20℃保存待用。

    扩增基因片段:以适量cDNA为模板，在Taq DNA聚合酶作用下合成PCR产物，并以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase, GAPDH)为内参照。GAPDH上游引物:5’一TTG CAGTGG CAA AGT GGA GA -3'，下游引物:5’一CTC GCT CCT GGA AGATGG TG -3'，扩增片段长度173bp;小鼠Jaggedl基因PCR扩增引物上游5’一AGC TCA CTT ATT GCT GCG GT -3'，下游5’一CCG CTT CCTTAC ACA CCA GT -3'，扩增片段长度为153bp;小鼠Notchl基因PCR扩增引物上游5’一GCT CCG AGG  AGA TCA ACG AG -3'，下游5'-TTG ACA TCA CCC TCA CAC CG -3'，扩增片段长度为268bp;小鼠Hess基因PCR扩增引物上游5’一TCC TTT GTA TGG GTG GGT GC -3',下游5’一CAG CCT GTG TTC TCC CAC AT -3'，扩增片段长度为81bp;利用SYBR荧光染料掺入法，于八联管中加入SYBR Mix 9川，cDNA模板2}1，上游引物0.6林1，下游引物0.6林1，加DEPC水至终体积20林10PCR反应参数:预变性95 0C 2分钟，然后95℃变性10秒，退火30秒  (GAPDH, Jaggedl , Notchl , Hess的退火温度分别是570C, 540C, 570C和60 0C)，68℃延伸45秒，共40个循环。每个样本做3个复孔取平均值以保证结果的可靠性。根据待测基因与管家基因的Ct值，用RQ值  2-ooct)表示待测基因的相对表达量。其具体计算方法如下:

   oCt=平均待测基因Ct一平均GAPDH Ct

    }}Ct=实验组△Ct一对照组△Ct

    mRNA相对表达量RQ=2-ooctyo}

5.2.5  Western  Blot法检测小鼠肝组织Jaggedl , Notchl , NICD和Hess

蛋白的表达，具体方法如下:

    肝组织总蛋白的提取:每(50-100 ) mg肝组织加入lml蛋白裂解液(裂解液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)进行匀浆，4℃放置60分钟以充分裂解肝组织，离心(13000转/分钟)15-30分钟，取上清液，测定浓度和纯度后立即变性或于一80℃保存待用。

    蛋白电泳、转移、标记抗体、显色及曝光留图:调整各样品蛋白浓度，使其一致。取等量肝组织蛋白，加入蛋白上样缓冲液，充分混匀后煮沸变性5分钟。12%或6%SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳分离蛋白条带，5%浓缩胶中80V恒压电泳(40-60)分钟，10%分离胶中120V恒压电泳  (1.5-2 )小时。应用半千电转法恒流(0.8mA/cm2)转移(20-110 )分钟，使凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上，置于封闭液((5%脱脂奶粉)中室温摇动封闭1小时，加一抗(Jaggedl , Notchl , NICD, Hess和GAPDH的抗体浓度均为1:1000 )，4℃过夜。洗膜后加辣根过氧化物酶标记的

二抗，室温摇动孵育1小时。应用ECL进行化学发光，暗室曝光，X胶片显影。扫描图片，应用BIO-PROFIF图像分析系统测定条带吸光度，以各指标条带与对应内参条带的吸光度比值作为该指标蛋白的相对表达~里‘。

5.2.6免疫组织化学染色方法检测小鼠肝组织CD68的表达

    采用Power VisionTM二步法对肝组织标本进行CD68免疫组化染色，

主要步骤如下:小鼠肝组织蜡块连续5 }m厚切片，常规脱蜡至水(二甲苯II :  10分钟，二甲苯I :  10分钟，100%酒精I.  5分钟，100%酒精II : 5分钟，90%酒精:5分钟，80%酒精:5分钟，自来水洗两次，蒸馏水洗一次);进行抗原修复:高压10分钟，后自然冷却至室温，蒸馏水洗一次;3 % H20:室温孵育15分钟，以封闭非特异性抗原，O.O1M PBS浸洗5分钟、3次;滴加试剂A室温孵育15分钟，倾去，勿洗;滴加CD68兔单克隆抗体(工作浓度分别为1:250 )，4℃冰箱过夜，O.O1M PBS洗5分钟、3次;滴加试剂B室温孵育15分钟，O.O1M PBS洗5分钟、3次;滴加试剂C室温孵育15分钟，O.O1M PBS洗5分钟、3次;DAB显色，

显色2分钟;蒸馏水终止显色，自来水冲洗，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。O.Olmol/LPBS代替一抗作为空白对照。细胞浆呈棕黄色为阳性细胞。用多功能病理图像分析软件测定CD68表达面积百分比，每张切片取四周及中央五个区域，20倍物镜下计算平均面密度，结果取

平均值。

6统计学处理

      实验数据以x士s表示，单因素方差分析前进行正态性及方差齐性检验，Least-Significant-Difference法进行组间比较，双侧P}0.05为差异有统计学意义，P}0.01为有显著统计学意义。相关性分析采用直线相关分析法。应用SPSS 13.0统计软件分析实验数据。

结果

1小鼠的一般情况

    正常对照组小鼠精神状态良好，食欲旺盛，对外界刺激或痛觉反应正常;ALF模型组小精神萎靡，进食减少，动作迟缓，对外界刺激反应减弱;益生菌千预组小鼠精神、食欲及对外界刺激反应介于正常对照组与急性肝衰竭模型组之间。

2各组小鼠生化指标、血清HMGB 1, IL-10及血浆LPS水平变  ALF模型组小鼠血清ALT  ( 848.404士94.828   U几)、AST (911.490士67.652 U几)、HMGB 1(101.909士12.428  }g/L)、IL-10(4627.884士842.453 pg/ml)和血浆LPS (11.801士0.887 EU/ml)水平均高于正常对照组(38.994士9.628 U/L, 55.279士7.499 U/L, 20.733士5.369dug/L,  1064.924士238.455 pg/ml, 0.578士0 .119 EU/ml )  ( P值均<0.01);而益生菌千预组血清ALT ( 689.891士84.649 U几)、AST ( 776.026士61.892U几)、HMGB 1(82.556士9.719 }g几)、IL-10(3182.596士769.235 pg/ml)和血浆LPS ( 7.396士0.919 EU/ml )水平均较ALF模型组明显降低(尸值均<0.01)(见Fig.l，Table 1-2 )。

3肝组织病理学变化

    光镜下，HE染色可见正常对照组小鼠肝组织内大小一致的肝细胞围绕肝小叶中央静脉呈放射状分布，肝细胞排列整齐，肝索结构完整;ALF模型组小鼠肝组织正常结构被破坏，索结构紊乱，可见大面积肝细胞坏死及大量炎性细胞浸润，残存肝细胞肿胀，呈气球样变;益生菌千预组小鼠肝细胞坏死及炎性细胞浸润程度均较ALF模型组改善(见Fig.2)。

4肝组织Jaggedl mRNA, Notchl mRNA, Hess mRNA的表达    Real time-PCR检测ALF模型组小鼠肝组织内Jaggedl mRNA,

Notchl mRNA, Hess mRNA表达量(分别为6.671士0.790, 5.491士0.657,6.301士0.930)较正常对照组明显增加(尸值均<0.01);而益生菌千预组Jaggedl mRNA(4.120士0.623)、Notch 1 mRNA(2.375士0.739)、Hess mRN  3.657士0.755)表达较ALF模型组明显减少(尸值均<0.01)，差异有

统计学意义(见Fig.3 ,   Table 3 )。

5肝组织Jaggedl , Notchl , NICD和Hess蛋白的表达

    Western Blot检测ALF模型组小鼠肝组织内Jaggedl蛋白

(0.631士0.067 ) , Notchl蛋白(0.620士0.096 ) , NICD蛋白(0.646士0.100) ,Hess蛋白(0.803士0.087 )均较正常对照组表达量(分别为0.339士0.071,

0.168士0.070, 0.114士0.050, 0.274士0.047)明显增加(P值均<0.01);与ALF模型组比较，益生菌千预组Jaggedl , Notchl , NICD和Hess蛋白表达量(分别为0.460士0.094, 0.371士0.101, 0.332士0.064, 0.605士0.097 )

明显减少(P值均<0.01或<0.05 )，差异有统计学意义(见Fig.4, Table4)。

6肝组织CD68蛋白的表达

    肝组织免疫组化染色显示ALF模型组小鼠肝组织CD68蛋白(0.631士0.067 }m2)较正常对照组(0.339士0.071 }m2)明显增加(尸X0.01) ;与ALF模型组比较，益生菌千预组CD68蛋白表达量(0.460士0.094 }m2 )明显减少(P}0.01)，差异有统计学意义(见Fig.S, Table 5 )。

7相关性分析

    小鼠血浆LPS水平与ALT, AST, Jaggedl mRNA, Notchl mRNA,Hess mRNA, Jaggedl蛋白、Notch 1蛋白、NICD蛋白、Hess蛋白、血清HMGB 1, IL-10水平及肝组织CD68蛋白的表达水平均呈正相关，相关系数分别为r=0.936, 0.946, 0.947, 0.945, 0.948, 0.894, 0.829, 0.926,

0.907, 0.942, 0.900, 0.973 (P值均<0.01)。

讨论

    ALF是肝衰竭的一种亚型，其病因和发病机制复杂，至今仍不十分明确。该病进展迅猛，预后极差，病死率极高，已成为最具挑战性的临床医学重点难点问题，首选治疗方案是肝移植。由于目前存在的现状，

如供肝缺乏，手术费用高，技术困难，以及术后长期使用免疫抑制剂出现副作用等，使得肝移植的应用受到一定的限制[t1‘一‘a}。近年来随着人工肝支持技术、分子吸附循环系统细胞移植等方法的发展，ALF患者虽

然未达到理想的治疗效果，但在为受损肝脏的肝细胞再生提供一定的时间，改善患者预后方面取得了进展[[13-18]。因此，改善病情，延缓疾病进展，延长生存时间，提高患者接受手术的几率是内科治疗的首要任务。

    众所周知，从疾病的发病机制入手是治疗的关键，本质上的改变往往会起到事半功倍的效果，ALF的治疗也不例外。由于很难在临床上对ALF患者进行发病机制的深入研究，故ALF动物模型在发病机制基础研究中的替代作用不容忽视，相对而言具有易操作、可重复、标本充足等特点。ALF动物模型主要包括外科手术模型、化学或药物模型、感染模型和基因修饰模型等。

      (1)外科手术模型是发展较早的ALF模型，包括肝缺血模型、部分或全肝切除模型。外科手术造成的肝脏缺血坏死和肝功能衰竭不可逆，故仅适用于生物人工肝代偿肝功能的研究，又由于生物人工肝系统支持的模型动物难以长时间存活，故该类模型往往用于体外人工肝系统的短期评价「。外科手术模型具有操作较复杂，存在强烈的手术反应，可

能改变肝功能衰竭的病理生理状态等缺点。

      (2)目前主要用于制备化学或药物模型的有四氯化碳、醋氨酚、刀豆球蛋白A, D-氨基半乳糖、LPS等。四氯化碳在体内被微粒体细胞色素P450氧化酶代谢后，生成毒性代谢产物，破坏生物膜结构，导致膜通透性增高，造成肝细胞死亡[[21 ]。除肝脏外，还可导致动物其他器官如肾、肺等的损害;醋氨酚是导致国外ALF的常见原因之一，是一种肝毒性药物，在八、九十年代已被广泛用于制造肝衰竭动物模型，正常剂量的醋氨酚可经葡萄糖代谢途径由肾脏排出，过量时则大部分转化为N-乙酞一苯醒亚胺，导致肝组织小叶中央型坏死。同四氯化碳类似，其除主要在肝脏代谢可造成肝衰竭以外，还具有心毒性、肾毒性和肺损伤等[22-24];由于这些药物均可导致肝脏以外的器官受损，使得造模时药物的使用剂量难以把握，同时也难以预测动物死亡的直接原因是否归于肝衰竭[[24]。故目前的化学或药物动物肝衰竭模型多选择肝特异性毒性物质进行制备，以避免上述情况的发生。刀豆球蛋白A就是这类物质中的一种，它是一种植物凝血素，可诱导动物发生ALF ,累及器官仅限于肝脏[[25]0

该模型与病毒性肝炎和自身免疫性肝炎所致肝损伤的发病机制相似，常用于此类疾病的研究。除此之外，D-氨基半乳糖也具有较强的特异性肝毒性作用，是氨基酸的一种，可通过破坏肝细胞膜完整性，造成严重的肝细胞坏死。该药物导致的肝衰竭是目前药物性肝衰竭中与临床病毒性ALF最为接近的比较理想的动物模型。D-氨基半乳糖动物ALF模型较好的模拟临床病毒性肝衰竭的发生、发展，以及模拟与临床相类似的病理、生理过程，具有肝外毒性不明显，效果可预测，用药剂量范围易控制等特点，但其价格昂贵。多见与小剂量LPS合用共同制备ALF动物模型，该方法可有效降低实验成本，提高动物对LPS的敏感性，二者协同导致肝衰竭。LPS的单独使用仅限于制备内毒素休克模型[}26}0

      (3)感染模型是应用肝炎病毒感染动物制备ALF模型的方法。ALF在我国的首要病因病毒性肝炎，该类模型的成功制备可更直接更有效地模拟临床常见ALF的发病过程，便于进行多方面多层次的研究，然而此种方法的失败率极高。迄今为止，只有少数动物感染模型制备成功}2}-2s}

      (4)基因修饰模型最早见于alb-uPA转基因小鼠模型，该小鼠体内过度表达的异位uPA可引起肝细胞坏死，发生肝衰竭[}29}。另外，延胡索酞乙酞乙酸水解酶基因敲除小鼠和以白喉毒素受体为媒介的转基因鼠均可导致肝脏损伤，出现ALF。该类模型主要用于研究代谢疾病，探讨肝细胞生长移植的可能性及其增生的潜能。

    本研究主要侧重LPS在ALF疾病进展中的作用机制，结合上述动物模型的相关内容，D-氨基半乳糖诱导的ALF模型为最佳选择。根据D-氨基半乳糖的自身特点，我们选取肝、脾与体重比值均较其他近交系小鼠大的BALB/c小鼠作为实验对象。预实验中我们分别选取1.2g/kg

  (参照李兰娟团队)、1.7g/kg, 2.2g/kg, 2.7g/kg, 3.2g/kg剂量的D-氨基半乳糖对小鼠进行腹注射制备ALF模型。由于后续试验的目的之一是观察疾病中晚期小鼠体内促炎细胞因子和抗炎细胞因子的失衡情况，文献报道作为检测指标之一的晚期重要炎症介质HMGB 1通常在机体受刺激后16-48h为分泌高峰期[30-31 ]，故所有小鼠需观察至48h。预实验结果显示48h时给予1.2g/kg,  1.7g/kg, 2.2g/kg, 2.7g/kg剂量腹腔注射的小鼠肝组织炎症坏死程度不严重，死亡率为0;而 3 .2 g/kg时肝组织结构大面积破坏，可见大片出血坏死，炎细胞大量浸润，小鼠34h即可出现死亡，死亡率为70%，故调整剂量为3.Og/kg观察48小时。同时结合小鼠死亡率、生化指标及肝组织病理结果，最终确立D-氨基半乳糖的剂量为3.Og/kg，并于腹腔注射3 6h ( HMGB 1分泌高峰)时处死全部实验小鼠。本实验ALF模型组小鼠肝组织正常结构遭到破坏，可见大面积出血坏死，且伴有大量炎性细胞浸润，结合肝功能 AST, ALT水平，证实ALF小鼠造模成功。

    内毒素血症是ALF发病机制之一，对疾病的进展发挥着重要作用。正常情况下，少量肠源性内毒素可经门静脉系统进入肝脏，被肝脏内巨噬细胞清除，维持肝脏内环境稳定。ALF时，肝功能异常引起人体神经一体液因素改变，导致严重的肠道菌群失调，此时肠道厌氧菌显著减少，肠杆菌过度生长，肠道定植力下降，肠壁屏障功能受损，最终造成肠道菌群移位，大量革兰阴性菌生长增殖代谢增快，内毒素产生增多。增多的内毒素同样经门静脉进入肝脏，一方面受损肝脏内的巨噬细胞吞噬功能障碍，不能有效清除过量的内毒素，导致血液循环中内毒素水平增高，引起肠源性内毒素血症，另一方面同损肝因素发挥协同作用加重肝脏负担，从而形成肝肠恶性循环。本研究发现ALF模型组血浆LPS水平明显升高，且与AST, ALT水平正相关，提示血浆LPS水平在一定程度上可间接反映肝脏损伤程度，在ALF的发生发展中发挥着关键作用。

    体内的LPS可诱发巨噬细胞表达与凋亡相关的细胞因子，直接导致肝细胞的损伤，主要包括Fast、肿瘤坏死因子2a, CD30L等。研究发现，LPS还可与LPS结合蛋白、可溶性CD 14形成三联复合物形式，作用于细胞膜受体，激活髓性分化因子88, IL-1R相关激酶、肿瘤坏死因子受体相关因子6，进一步介导多种跨膜及细胞内信号传导，如激活丝裂原激活的蛋白激酶信号转导通路和NF-KB信号转导通路，促使多种细胞因子及炎性介质的产生，参与AL的疾病进展[[32-35]。除上述经典的信号通路外，最新研究显示，Notch信号通路在LPS诱发炎性细胞因子产生过程中也发挥着至关重要的作用。肠源性内毒素血症重要的晚期炎症介质HMGB 1和抗炎因子IL-10的分泌均与LPS激活的Notch信号通路有关[6， 。本研究发现ALF模型组小鼠Notch信号通路及炎症相关指标均较正常对照组明显升高(其中Notch 1与NICD基因类似，故仅检测Notch 1 mRNA的表达)，并以HMGB 1升高为主，且与血浆LPS水平呈正相关，提示LPS激活Notch信号通路调控炎症相关因子HMGB 1,IL-10的分泌可能ALF的发病机制之一。CD68是一种高度糖基化的膜蛋白，主要位于细胞质内，与细胞内吞及胞内转运有关。当巨噬细胞活化时，CD68表达增加，被认为是巨噬细胞活化的标记物[9]。本研究发现巨噬细胞的活化标记物CD68蛋白与血浆LPS水平呈正相关，在ALF模型组肝组织内CD68蛋白的表达量明显升高，提示肝脏内的巨噬细胞活化可能与血浆LPS水平升高有关。目前Notch信号通路对于炎症因子的调控作用尚存在争议[36一，从动物水平转入细胞水平的研究，即观察LPS激活巨噬细胞内Notch信号通路发挥何种调控作用，是我们后续研究的重点。

    在临床上，直接有效降低血浆内毒素水平的药物是微生态制剂，主要包括益生菌、益生元、合生素。益生菌是指对肠道内菌群平衡有益的活的微生态制剂，可分为多联活菌制剂和单菌制剂。益生元是一种膳食补充剂，选择性刺激一种或多种细菌的生长与活性，为人体益生菌提供“养料”，改善寄主健康。合生素，是将益生菌与益生元合并应用的一类制剂，它既可发挥益生菌的优势，又可选择性增加该种细菌的数量，益生作用显著加强。本研究应用的双歧杆菌乳杆菌三联活菌(金双歧)是由长型双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌三种活性成分组成的益生菌，主要作用原理是益生菌通过磷壁酸与肠道粘膜上皮细胞紧密结

合，形成生物屏障，同时细菌代谢产生的酸性物质可降低肠道PH值，抑制革兰氏阴性腐败菌的定植、存活和生长，从而减少内毒素的生成吸收，降低血液循环系统中内毒素的水平。我们通过对益生菌千预组的观察发现，与ALF模型组比较，血浆LPS、生化指标、肝组织内Notch信号通路相关指标及血清HMGB 1, IL-10水平均显著下降，肝组织炎症坏死程度明显得到改善，提示益生菌通过降低血浆LPS水平发挥对肝脏的保护作用，可能与抑制Notch信号转导通路有关。

    综上所述，肠源性内毒素血症是ALF发病机制之一，由肠道菌群异位导致血浆LPS水平的升高可激活肝脏内Notch信号通路，从而调控炎J陛介质如HMGB 1, IL-10的分泌，其中以促炎因子HMGB 1升高为主，从而进一步加重肝脏损伤，该恶性循环在ALF的发生发展中具有至关重要的作用。益生菌的应用可显著降低血浆LPS水平改善肝脏损伤程度，肝内Notch信号通路可能参与了其对肝脏的保护作用。其中，巨噬细胞在整个动态变化过中也发挥着关键作用。这为临床上应用益生菌预防ALF提供了新的理论依据。

小结

    1应用D-氨基半乳糖腹腔注射小鼠可以成功复制ALF模型，其中血浆LPS水平的升高在ALF的发生发展中发挥着关键作用。

    2 ALF小鼠肝组织中激活的Notch信号通路可调控相关炎症因子的分泌，参与肝脏的损伤过程。

3益生菌可通过抑制Notch信号转导通路保护肝脏，为临床预防ALF提供了新的思路和方向。

参考文献

中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组，中华医学会肝病学分会重型肝痛与人工肝学组.肝衰竭诊治指南(2012年版).中华肝脏病杂志，2013, 21(3): 177-183Wongchana W, Palaga T. 略。。。。